【摘要】：由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis, M. tuberculosis)引起的結(jié)核病(Tuberculosis),目前仍是威脅全球公共衛(wèi)生安全的重大傳染病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)2013年數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示：2012年在全球范圍內(nèi)共有結(jié)核病新發(fā)病例860余萬；導致約130萬人死亡；其中近32萬是與艾滋病(Acquired immune deficiency syndrome, AIDS)共感染。中國是全球22個結(jié)核病高負擔國家之一,2012年全國共有新發(fā)病例大約95萬,并且隨著耐藥(Drug resistance)尤其是耐多藥(Multi-drug resistant)和廣泛耐藥(Extensively drug resistance)菌株的出現(xiàn)、與艾滋病共感染的病例增加,結(jié)核病的防控形勢依舊十分嚴峻。細菌感染人體后,大部分在抗生素的作用下被殺死,然而小部分細菌能夠逃避藥物的治療以及機體的免疫殺傷從而長期潛伏于機體內(nèi),成為持留菌(persistent cells)。這一現(xiàn)象首先由Joseph Bigger在1944年發(fā)現(xiàn),該部分持留菌在基因型上和被抗生素殺死的敏感菌沒有區(qū)別,但是由于它們進入了不進行復制的休眠狀態(tài)(dormant state)從而能夠逃逸抗生素的殺傷。有研究結(jié)果顯示,持留性細菌的形成與TA系統(tǒng)(Toxin-Antitoxin)的隨機表達有關(guān)。在分枝桿菌研究領域,有結(jié)果證明phoY2對結(jié)核分枝桿菌持留性的形成不可或缺,并且該結(jié)論與在E.coli中對phoY2同源基因phoU的研究結(jié)果相一致。但是由于海分枝桿菌缺乏相應的TA系統(tǒng),故對分枝桿菌尤其是海分枝桿菌持留性的研究及其形成機制目前尚不清楚。多聚磷酸鹽(Poly Pi)廣泛存在于細菌、古細菌、真菌、原蟲、植物以及動物中。其在生物體內(nèi)由多聚磷酸激酶(polyphosphate kinase, PPK)直接合成,主要通過外切磷酸酶(exopolyphosphatase, PPX)水解,poly Pi的平衡需要通過PPK以及PPX的協(xié)同調(diào)節(jié)。PPK存在于許多細菌中,但是在真核細胞中缺失。Poly Pi在機體代謝調(diào)控過程中發(fā)揮著重要作用：調(diào)節(jié)機體內(nèi)ATP的含量；重金屬離子如鎂、鈣離子等的螯合物；扮演DNA通道來控制細胞內(nèi)外DNA的進出。此外,在原核生物中,poly Pi能邑作為信號分子(messenger)參與細菌對環(huán)境壓力的應急性應答(Stringent response). Poly Pi的失衡對于細菌生物膜的形成以及Quorum sensing系統(tǒng)對信號的感知均有影響,并且造成細菌毒力的減弱。SenX3-RegX3是結(jié)核分枝桿菌所編碼的11個雙組份系統(tǒng)(two-component regulatory systems,2CRs)之一。細菌通過自身編碼的2CRs感知周圍環(huán)境的變化,并且有報道顯示部分2CRs和細菌毒力相關(guān)。由研究結(jié)果表明,結(jié)核分枝桿菌特異性磷酸轉(zhuǎn)運(phosphate-specific transport, Pst)系統(tǒng)pstS3-pstC2-pstA1在磷酸饑餓的環(huán)境下表達上調(diào),該表達變化依賴于SenX3-RegX3,并且RegX3為細菌在磷酸饑餓以及小鼠肺部的存活所必需。在恥垢分枝桿菌中(M. smegmatis), SenX3-RegX3對基因的調(diào)控依賴于外界磷濃度的變化。此外,SenX3-RegX3調(diào)控結(jié)核分枝桿菌ΔpstAl在磷豐富培養(yǎng)基中基因的表達,并且細菌在外界壓力條件下以及宿主體內(nèi)的存活依賴于Pst系統(tǒng)對RegX3活性的負向調(diào)控。但是,SenX3-RegX3和細菌對外界磷濃度反應之間的具體信號轉(zhuǎn)導以及調(diào)控機制目前仍不清楚。本實驗室之前的研究結(jié)果顯示,M. marinum中phoY2基因的插入失活導致胞內(nèi)poly Pi以及ATP濃度上調(diào)；處于poly Pi和ATP代謝失調(diào)的phoY2::Tn (05A9)菌株對體外高濃度磷酸鹽以及細胞壁裂解劑(SDS)、營養(yǎng)缺陷、抗生素等環(huán)境壓力更為敏感；此外,其對低氧環(huán)境的適應過程也受到了影響。本論文在此基礎上,通過劉phoY2::Tn突變株的進一步研究發(fā)現(xiàn)：phoY2基因的缺失導致數(shù)百個基因的表達發(fā)生了變化,其中包括與磷轉(zhuǎn)運調(diào)控相關(guān)的Pst以及雙組分系統(tǒng)senX3/regX3;通過反義RNA技術(shù)降低PPK活性及突變株體內(nèi)poly Pi的濃度后,體內(nèi)poly Pi濃度已經(jīng)降低至野生株水平的phoY2::Tn菌株在體外高濃度磷酸鹽、SDS、營養(yǎng)缺陷、抗生素等條件下的表型沒有發(fā)生變化；PhoY2與Pst系統(tǒng)以及PhoP/PhoR之間在蛋白水平未檢測到相互作用；senX3/regX3啟動子活性在突變株中明顯高于野生株,對該區(qū)域進一步分析的結(jié)果顯示,該區(qū)域的轉(zhuǎn)錄活性受不同調(diào)控因子共同調(diào)節(jié)；此外,phoY2::Tn菌株在體外持留性(persistence)相比于野生株(WT)顯著下降。(論文第一章)結(jié)核分枝桿菌引起疾病的第一步是成功阻止宿主體內(nèi)巨噬細胞對其的殺傷。絕大多數(shù)的病原菌被巨噬細胞內(nèi)吞后,都被包裹在吞噬小體中,隨著吞噬小體的成熟,這些病原菌被轉(zhuǎn)移至溶酶體,在那里被降解。但是結(jié)核分枝桿菌能夠成功的阻斷吞噬小體和溶酶體的融合,所以能夠長時間的在巨噬細胞中存活。關(guān)于此過程的分子機制目前尚不清楚。蛋白激酶G(PknG)能夠通過阻斷吞噬小體和溶酶體的融合,促進結(jié)核分枝桿菌在宿主體內(nèi)的存活。PknG是結(jié)核分枝桿菌基因組編碼的11個真核細胞樣絲氨酸／蘇氨酸激酶之一(從PknA到PknL)。它是一個多功能域蛋白,在保守的激酶催化活性功能域兩端分別有未知功能的C端和N端功能域。N端序列包含自身磷酸化位點和一個紅素氧還蛋白樣結(jié)構(gòu)域(rubredoxin-like domain, Rbx),其激酶活性以及自磷酸化對于分枝桿菌在巨噬細胞中的存活有重要作用。此外,如果對PknG進行基因水平的阻斷或者使用化合物對其活性進行抑制,會導致含有結(jié)核分枝桿菌的吞噬小體和溶酶體的融合,進而殺傷巨噬細胞內(nèi)的病原菌。但是,PknG的底物尚未被發(fā)現(xiàn)；PknG具體通過何種途徑阻斷吞噬小體與溶酶體的融合,進而影響分枝桿菌在巨噬細胞內(nèi)的存活,機制尚不清楚。PknG通過何種方式分泌至細菌體外,從而在巨噬細胞細胞質(zhì)中阻斷吞噬小體與溶酶體的融合是另一個值得研究的問題。分枝桿菌擁有不同的蛋白分泌系統(tǒng),包括SecA附屬分泌系統(tǒng)SecA2。通過對海分枝桿菌野生型和secA2突變株細胞表面成分進行蛋白質(zhì)組學的分析,我們發(fā)現(xiàn)PknG在兩種菌株細胞表面的分布有明顯變化。此外,secA2突變株存在許多與pknG突變株相似的表型,包括吞噬小體的成熟,代謝變化以及在斑馬魚胚胎模型中肉芽腫形成能力減弱。但是,PknG與SecA2之間的相互關(guān)系以及對海分枝桿菌毒力的影響仍需要進一步的研究。為了研究在巨噬細胞中過表達的PknG是否足夠回補pknG敲除株中PknG的功能,從而阻止細菌被轉(zhuǎn)移至溶酶體中被清除,我們在鼠源的J774巨噬細胞系中采用以質(zhì)粒為基礎的手段過表達了PknGo在此基礎上,我們采用共聚焦顯微鏡和細菌侵染細胞計數(shù)(CFUs)的方法研究了pknG敲除株在過表達PknG的巨噬細胞中存活的狀況。結(jié)果顯示在巨噬細胞中外源表達的PknG能夠完全回補海分枝桿菌pknG基因缺失所造成的毒力減弱。我們的研究對PknG在阻斷吞噬小體和溶酶體的融合,進而促進病原菌在宿主體內(nèi)存活的機制提供了更深刻的認識。此外,為了研究PknG與SecA2之間的相互關(guān)系以及對海分枝桿菌毒力的影響,我們用secA2突變株對外源性過表達了PknG的巨噬細胞進行侵染,利用共聚焦顯微鏡對侵染結(jié)果進行分析,結(jié)果顯示在巨噬細胞中過表達的PknG能夠部分回補SecA2的毒力,從而進一步闡明了PknG與SecA2分泌系統(tǒng)的關(guān)系(論文第二章)。轉(zhuǎn)錄組的研究對于揭示基因表達以及轉(zhuǎn)錄水平復雜的調(diào)控具有重要作用。RNA測序(RNA-seq)是用于轉(zhuǎn)錄組分析的一個強大工具,它采用深度測序技術(shù)直接確定cDNA序列。海分枝桿菌是研究結(jié)核分枝桿菌致病機制的有效模型,在本研究中,我們利用RNA-seq對海分枝桿菌的轉(zhuǎn)錄組進行分析。在使用物理方法去除核糖體RNA(rRNA)后,我們獲得了海分枝桿菌對數(shù)生長期以及平臺早期兩套轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。在此基礎上,我們系統(tǒng)性地描述了兩個時期間差異化表達的基因及其功能分類。此外,我們還在全基因組范圍內(nèi)預測了360個共轉(zhuǎn)錄單元(operon),并且我們隨機選取了17個預測的共轉(zhuǎn)錄單元進行RT-PCR驗證,其中13個存在共轉(zhuǎn)錄現(xiàn)象�？偟膩碚f,我們的研究初步揭示了海分枝桿菌的轉(zhuǎn)錄組,這對闡明結(jié)核分枝桿菌在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控及其致病機制具有借鑒意義。(論文第三章)
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R378.911

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本文編號：2694359