【摘要】： 腦挫傷(cerebral contusion)常常引起神經(jīng)細(xì)胞大量死亡和嚴(yán)重的神經(jīng)功能障礙。一般說來,中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺乏再生能力。研究認(rèn)為治療腦挫傷的關(guān)鍵是:移植外源性細(xì)胞來補(bǔ)充或替代損失的神經(jīng)細(xì)胞;促進(jìn)殘存的神經(jīng)細(xì)胞存活及軸突生長;重建功能性突觸。神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells, NSCs)可以在受體中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)補(bǔ)充或替代損失的細(xì)胞;參與神經(jīng)結(jié)構(gòu)的重建;改善損傷局部的微環(huán)境;促進(jìn)神經(jīng)再生。因此,NSCs移植治療腦挫傷具有良好的應(yīng)用前景。在本研究中,我們探討體外分離大鼠胚胎前腦NSCs的方法,原代和傳代培養(yǎng)方法和NSCs的鑒定;觀察NSCs培養(yǎng)特性、分化機(jī)理及誘導(dǎo)條件,進(jìn)一步探討將NSCs植入大鼠腦挫傷灶周邊區(qū)成活、遷移和分化情況。 1.大鼠胚胎前腦神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)分化的研究 實驗于2008年11月至2009年10月在河北北方學(xué)院實驗中心完成。清潔級,E 16d的Wistar孕鼠(由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所提供)在無菌條件下取其胚胎,分離出前腦,制備單細(xì)胞懸液,以1×106·ml-1和1×108·ml-1分別接種于含N2的DMEM/F12培養(yǎng)瓶中,加入終濃度為20ng·ml-1表皮細(xì)胞生長因子(epidermal growth factor, EGF)和10ng·ml-1堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)刺激其克隆生長。誘導(dǎo)分化實驗分為懸浮培養(yǎng)實驗和爬片培養(yǎng)實驗。a懸浮培養(yǎng)實驗分為三組:體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS) +20ng·ml-1 EGF +10ng·ml-1 bFGF,10%FBS,20%FBS,在上述誘導(dǎo)條件下刺激其分化。b爬片培養(yǎng)實驗分為三組:多聚賴氨酸鋪板組、明膠鋪板組和無鋪板組,采用體積分?jǐn)?shù)為20% FBS刺激分化。研究采用免疫細(xì)胞化學(xué)和間接免疫細(xì)胞熒光染色法檢測NSCs巢蛋白(nestin)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acid protein, GFAP)、神經(jīng)元特異性烯醇化酶(neuron-specific enolase, NSE)和微管相關(guān)蛋白2(microtubule-associated protein 2, MAP-2)。結(jié)果成功從胎鼠前腦分離出神經(jīng)干細(xì)胞,巢蛋白表達(dá)陽性。a懸浮培養(yǎng)實驗在不同誘導(dǎo)條件下,20%FBS組促分化作用略強(qiáng)于10% FBS組(P0.05)。10% FBS組促分化作用強(qiáng)于10%FBS +20ng·ml-1 EGF +10ng·ml-1 bFGF組(P0.05)。NSCs分化為神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。b爬片培養(yǎng)實驗中,多聚賴氨酸鋪板組和明膠鋪板組貼壁后分化為神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的能力強(qiáng)于無鋪板組(P0.01)。多聚賴氨酸鋪板組略強(qiáng)于明膠鋪板組(P0.05)。神經(jīng)譜系標(biāo)記物中的GFAP,NSE和MAP-2免疫細(xì)胞化學(xué)及間接免疫細(xì)胞熒光染色均陽性。結(jié)論:大鼠胚胎前腦NSCs可以通過體外培養(yǎng)獲得,且具有增殖能力和多向分化潛能。20%血清組NSCs分化顯著,10%FBS+EGF +bFGF組NSCs分化不顯著。多聚賴氨酸和明膠作為細(xì)胞貼壁支持物可以提高分化細(xì)胞數(shù)量,而且多為星形膠質(zhì)細(xì)胞。 2.神經(jīng)干細(xì)胞在大鼠腦挫傷灶周邊區(qū)成活和遷移 本研究利用體外無血清培養(yǎng)技術(shù),加EGF和bFGF刺激大鼠胚胎源性前腦NSCs克隆增殖。傳1代后,NSCs在培養(yǎng)過程中加入終濃度為6μg·ml-1 5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromodeoxyuridine, BrdU)。標(biāo)記BrdU的NSCs,用免疫細(xì)胞化學(xué)和間接免疫細(xì)胞熒光染色檢測其增殖能力。研究采用改進(jìn)的Fenney’s自由落體腦挫傷模型,于致傷1d后,將NSCs用立體定位法移植到鼠腦挫傷灶邊緣皮層內(nèi),免疫組化及免疫熒光雙染法觀察移植后1,7,14,21d NSCs在挫傷灶周邊成活,遷移和分化情況。結(jié)果,移植后1,7,14,21d,損傷灶BrdU陽性細(xì)胞數(shù)目逐漸減少;BrdU陽性細(xì)胞在損傷灶周邊散在分布,并向損傷皮層下遷移。損傷后灶區(qū)GFAP表達(dá)上調(diào),并在時間上具有一定規(guī)律性。結(jié)論:本研究結(jié)果顯示,大鼠胚胎前腦獲得的NSCs在異體移植后,能夠在受體大鼠腦損傷灶周邊區(qū)存活和遷移;形態(tài)學(xué)上,其顯示出與腦組織整合的特點。
【學(xué)位授予單位】：河北北方學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R329

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 張樹庸;;神經(jīng)干細(xì)胞有望助腦瘤患者修復(fù)認(rèn)知[J];實驗動物科學(xué);2011年04期

2 ;中國神經(jīng)干細(xì)胞研究領(lǐng)域——專家介紹[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2011年32期

3 ;外源性信號調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2011年27期

4 ;德國馬普學(xué)會發(fā)現(xiàn)非基因技術(shù)神經(jīng)干細(xì)胞培育新方法[J];中國科技信息;2011年15期

5 ;人類腦損傷后神經(jīng)有望修復(fù)[J];健康生活;2011年09期

6 楊華;賈原;路建宏;;淺述神經(jīng)干細(xì)胞及其在神經(jīng)退行性疾病治療中的應(yīng)用[J];山西中醫(yī);2010年S1期

7 段建輝;祝曉玲;李學(xué)軍;;神經(jīng)干細(xì)胞衰老基礎(chǔ)與臨床研究進(jìn)展[J];國際病理科學(xué)與臨床雜志;2011年04期

8 佟雷;佟曉杰;;JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路對神經(jīng)干細(xì)胞增殖的影響[J];解剖學(xué)研究;2011年02期

9 張儒有;鄭永日;郭薇;胡韶山;;不同損傷時期人腦挫裂傷對神經(jīng)干細(xì)胞分化影響的體外研究[J];航空航天醫(yī)學(xué)雜志;2011年06期

10 王金剛;尹忠民;聞華;;干細(xì)胞在腦性癱瘓治療中的應(yīng)用[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2011年23期

相關(guān)會議論文 前10條

1 孫一睿;胡錦;王爾松;奚才華;姚海軍;;單層黏附培養(yǎng)技術(shù)在哺乳動物神經(jīng)干細(xì)胞體外穩(wěn)定增殖和多向分化中的應(yīng)用[A];中國醫(yī)師協(xié)會神經(jīng)外科醫(yī)師分會第四屆全國代表大會論文匯編[C];2009年

2 李力;萬琪;劉永紅;張巍;;小鼠神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)及缺血神經(jīng)元對其增殖、分化的影響[A];科技、工程與經(jīng)濟(jì)社會協(xié)調(diào)發(fā)展——中國科協(xié)第五屆青年學(xué)術(shù)年會論文集[C];2004年

3 田東萍;蘇敏;吳賢英;張舸;;硒、B-27在神經(jīng)干細(xì)胞球存活與分化中的作用[A];中華醫(yī)學(xué)會病理學(xué)分會2005年學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2005年

4 楊華靜;徐鵬;張?zhí)K明;;低濃度β-淀粉樣蛋白對神經(jīng)干細(xì)胞的作用機(jī)制研究[A];第十一屆全國神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2008年

5 文玉軍;王登科;孫征;劉海洋;張蓮香;秦毅;;成年和老年大鼠腦出血后海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞的變化[A];中國解剖學(xué)會2011年年會論文文摘匯編[C];2011年

6 張波;王任直;;腦梗死后神經(jīng)干細(xì)胞原位增殖及其機(jī)理的實驗研究[A];中國微循環(huán)學(xué)會第五屆中國微循環(huán)學(xué)術(shù)大會論文摘要匯編[C];2004年

7 邢雪松;呂威力;;Wnt-1在大鼠腦缺血再灌注海馬組織內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞早期增殖分化中的作用[A];創(chuàng)新沈陽文集（B）[C];2009年

8 朱慧;李曉紅;戚菁;施維;吳信華;陸玉華;鞠少卿;劉炎;;Pax3負(fù)性調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞分化過程中膠質(zhì)纖維酸性蛋白的表達(dá)[A];2010’全國腫瘤分子標(biāo)志及應(yīng)用學(xué)術(shù)研討會暨第五屆中國中青年腫瘤專家論壇論文匯編[C];2010年

9 李革飛;李劍平;;應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測神經(jīng)干細(xì)胞表面標(biāo)志物-Nestin[A];中國輸血協(xié)會第五屆輸血大會論文專集（摘要篇）[C];2010年

10 姚立松;劉天慶;葛丹;崔占峰;馬學(xué)虎;;海藻酸鈣微膠珠培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞[A];第一屆全國化學(xué)工程與生物化工年會論文摘要集(下)[C];2004年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 時仲省 高思敏;移植神經(jīng)干細(xì)胞 癱瘓兔子可爬行[N];大眾衛(wèi)生報;2001年

2 王成應(yīng);能克隆的神經(jīng)干細(xì)胞被分離[N];健康報;2004年

3 記者 張忠霞;美國科學(xué)家首次從大鼠胚胎中提取干細(xì)胞[N];新華每日電訊;2008年

4 北京康復(fù)中心神經(jīng)外科 黃紅云;神經(jīng)干細(xì)胞之謎[N];健康報;2008年

5 張忠霞;首次!大鼠胚胎中成功提取干細(xì)胞[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報;2009年

6 孫國根;神經(jīng)干細(xì)胞并非“全能制造者”[N];中國醫(yī)藥報;2009年

7 劉海英;腦癌源于腦下室區(qū)的神經(jīng)干細(xì)胞[N];科技日報;2009年

8 劉霞;美將成人皮膚細(xì)胞變成神經(jīng)干細(xì)胞[N];科技日報;2011年

9 孫國根　白毅;靈長類腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞被發(fā)現(xiàn)[N];中國醫(yī)藥報;2011年

10 沈麗 付鈺;神奇的神經(jīng)干細(xì)胞[N];科技日報;2002年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 董云玲;神經(jīng)干細(xì)胞移植治療無神經(jīng)節(jié)細(xì)胞性巨結(jié)腸病的實驗研究[D];山東大學(xué);2008年

2 鄭敏;神經(jīng)干細(xì)胞定向分化與移植治療帕金森病的實驗研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2003年

3 盧洪流;成年大鼠腦內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的在體研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2001年

4 李巍;神經(jīng)干細(xì)胞的分化調(diào)控及BDNF基因修飾后對大鼠脊髓損傷修復(fù)的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2002年

5 張力;人胚神經(jīng)干細(xì)胞及骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植治療帕金森病恒河猴模型的實驗研究[D];復(fù)旦大學(xué);2003年

6 戴宜武;骨髓基質(zhì)細(xì)胞定向分化為神經(jīng)干細(xì)胞及自體移植治療中腦損傷研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2002年

7 張所軍;神經(jīng)干細(xì)胞向膠質(zhì)瘤干細(xì)胞遷移及對其生長特性的影響[D];華中科技大學(xué);2011年

8 張在金;神經(jīng)干細(xì)胞移植治療大鼠腦創(chuàng)傷的實驗研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2005年

9 尹豐;人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞治療帕金森病的實驗與臨床研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2006年

10 劉慧娟;G-CSF對體外培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞及其對缺血缺氧性腦損傷的作用及機(jī)制研究[D];山東大學(xué);2010年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 張力;大鼠胚胎前腦神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)及植入腦挫傷灶的形態(tài)學(xué)觀察[D];河北北方學(xué)院;2010年

2 馮年花;人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞向神經(jīng)干細(xì)胞分化的實驗研究[D];南昌大學(xué);2010年

3 宋精梅;比較新生大鼠腦部不同部位的神經(jīng)干細(xì)胞被誘導(dǎo)分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞的差異[D];福建醫(yī)科大學(xué);2010年

4 李政;內(nèi)皮祖細(xì)胞調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞分化及其機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2010年

5 王念;絞股藍(lán)皂苷對脊髓源神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響[D];陜西師范大學(xué);2011年

6 劉朋;海藻酸鈣/明膠微膠珠的制備及在神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用[D];大連理工大學(xué);2011年

7 郭兵;大鼠羊膜上皮細(xì)胞體外向類神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化及其移植后對視神經(jīng)再生的作用[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2010年

8 吳琿;神經(jīng)干細(xì)胞玻璃化凍存及其生物學(xué)特性的研究[D];大連理工大學(xué);2011年

9 黃劍侯;神經(jīng)干細(xì)胞植入損傷脊髓的動物實驗研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2006年

10 王培福;大鼠神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2002年

，

本文編號：2691893