發(fā)布時(shí)間：2020-06-01 22:27

【摘要】： 轉(zhuǎn)錄因子及其它許多在細(xì)胞增殖、分化等方面發(fā)揮重要作用的蛋白如組蛋 白、DNA和RNA聚合酶、RNA加工蛋白等均在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)揮作用、大多數(shù) 核內(nèi)蛋白需要內(nèi)源性的核定位信號(hào)（nuclear localization signal，NLS）幫助其穿 越核孔復(fù)合物而進(jìn)入細(xì)胞核。這個(gè)過(guò)程包括轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（又稱NLS-結(jié)合蛋白） 識(shí)別和結(jié)合帶有NLS的蛋白，并攜帶其�？坑诤四ど�，然后以耗能的主動(dòng)運(yùn) 轉(zhuǎn)方式使之進(jìn)入細(xì)胞核。盡管核蛋白的胞漿——胞核轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制目前尚未完全 清楚，但是這個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)在進(jìn)化過(guò)程中非常保守。從酵母到哺乳類，核孔復(fù) 合物的結(jié)構(gòu)非常相似，轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也具有很高的同源性。因此，哺乳類蛋白的 NLS在酵母細(xì)胞中同樣可以發(fā)揮作用。據(jù)此，我們利用酵母構(gòu)建了從cDNA 文庫(kù)中捕獲核定位蛋白基因片段的遺傳篩選系統(tǒng)——核定位信號(hào)篩選系統(tǒng)。 該系統(tǒng)包括兩個(gè)部分：一是酵母穿梭載體，可表達(dá)不含NLS的人工轉(zhuǎn)錄因子， 并含有一個(gè)出核信號(hào)（nuclear export signal、NES）以保證在沒(méi)有NLS存在時(shí) 人工轉(zhuǎn)錄因子定位于胞漿而不能進(jìn)入細(xì)胞核激活轉(zhuǎn)錄。二是酵母宿主，其基 因組中含有由人工轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的報(bào)告基因。將cDNA文庫(kù)插入人工轉(zhuǎn)錄因 子下游的多克隆位點(diǎn)后轉(zhuǎn)化酵母宿主。如果與人工轉(zhuǎn)錄因子融合表達(dá)的cDNA 第四軍區(qū)大學(xué)俗士學(xué)位論文 編碼一 NLS，人工轉(zhuǎn)錄因子就可進(jìn)入細(xì)胞核而激活報(bào)告基因的轉(zhuǎn)錄，表現(xiàn)為 酵母可在選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，反之則不能。因此利用這個(gè)方法理論上可以 從 CDNA文庫(kù)中篩選到所有的核定位蛋白基困。 本研究的主要內(nèi)容包括： 1，設(shè)計(jì)并構(gòu)建了核定位信號(hào)篩選系統(tǒng)，利用已知的編碼＊u和不編碼＊u 的基因片段進(jìn)行了驗(yàn)證，證實(shí)了該系統(tǒng)能夠有效地甄別表達(dá)的融合蛋白中 NLS的有無(wú)。驗(yàn)證了NLS在蛋白質(zhì)中的位置不會(huì)影響篩選的效果． 2，將小鼠胚胎的cDNA文庫(kù)插入篩選栽體的多克隆位點(diǎn)，轉(zhuǎn)化酵母宿主，，其 中約 l～2O的克隆可在選擇性平板上生長(zhǎng)。DNA序列分析表明 600’J上的 克隆的插入片段可編碼典型或不典型的NLS并與載體中的人工轉(zhuǎn)錄因子正 確融合。用EGFP融合的方法驗(yàn)證它們?cè)诓溉閯?dòng)物細(xì)胞中的定位，證實(shí)了 這一系統(tǒng)能夠有效地從 CDNA文庫(kù)中篩選出核定位蛋白基因片段。因此這 一系統(tǒng)可作為大規(guī)模篩選核定位蛋白基困的一種有效途徑。從文庫(kù)篩選出 來(lái)的基因中，選取了兩個(gè)基因，分別代表已知和未知、有典型NLS和無(wú)典 型NLS．對(duì)它們進(jìn)行了初步的功能研究． 3，Txrebl07肛pL6 的研究：利用核定位信號(hào)篩選系統(tǒng)確定核糖體蛋白 L6（山osomal Protein L6，RPL6）的 NLS的位置，并在體外培養(yǎng)的細(xì)胞中加以 證實(shí)。氨基端的3041和68－84 AL酸殘基具有核定位及核仁定位功能。 隨看表達(dá)量的提高，RpLO逐漸從核仁定位而成為全細(xì)胞核定位。Normem 雜交和RTPCR的結(jié)果顯示，在胚胎期和未分化的細(xì)胞中Taxreb107呵L6 的表達(dá)量明顯高于成熟組織和已分化的細(xì)胞。RpL6又稱Taxr eb 07廠 resPonslvedeme血bindee erotei…，是HTLVI原癌蛋白Tx應(yīng)答序夕J結(jié)合 蛋白．通過(guò)篩選噬菌體文庫(kù)克隆了 Taxrb 07伽L6的基困組基困，并對(duì)外 顯子吶含子的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析．Taxrebl07／RpL6的啟動(dòng)子含有多種包括 NF－KB在內(nèi)的特殊轉(zhuǎn)錄因子的識(shí)別位點(diǎn)。我們發(fā)現(xiàn)，Taxrb 07帥L6的啟 動(dòng)子具有持續(xù)激活的特點(diǎn)。Tx對(duì) Taxreb 07／RpL6的表達(dá)和啟動(dòng)子的活性 一 下四軍醫(yī)大掌協(xié)士學(xué)位論文 具有上調(diào)的作用，這種作用是通過(guò)啟動(dòng)子上的NFch識(shí)別位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)的。由 于 HTLVIS’LTR中的 Txrebl07帥L6識(shí)別序歹］對(duì) Tx的反式激活有促進(jìn) 作用，而我們又發(fā)現(xiàn)Taxr N07wL6能夠與Tx直接進(jìn)行相互作用，所O， Tx通過(guò)NF－oh上調(diào) Taxrb107瓜pL6的表達(dá)，＆ Taxrbl07服pL6可能 作用于5’LTR及細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成，n ＆促進(jìn)T HTLV病毒感染細(xì)胞的 增生和病毒基因組的復(fù)制。此外，Taxlebl 07徹L6的表達(dá)還受到INF和EPO 的調(diào)控�？傊�，Taxrebl07伽L6可能通過(guò)多種途徑參與了細(xì)胞的增生、分 化及轉(zhuǎn)化等多種生理和病理活動(dòng)。 4，新的核蛋白 J207的研究：我們篩選到一個(gè)功能未知的，J、鼠的 CDNA，全長(zhǎng) 共1802七，開(kāi)放讀框有1464七，編碼488個(gè)氨基酸。PSORT軟件分析 表明，J207沒(méi)有典型的核定位信號(hào)，但它具有七次跨膜樣的結(jié)構(gòu)域和分泌 性信號(hào)肽樣的結(jié)構(gòu)域。利用核定位信號(hào)篩選系統(tǒng)及體外培養(yǎng)的細(xì)胞都證實(shí) 全長(zhǎng)的J207確實(shí)定位于細(xì)胞核中。按照軟件分析的結(jié)果將全長(zhǎng)片段分為。細(xì) 胞外段” 和“細(xì)胞內(nèi)及段跨膜區(qū)”，分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)“細(xì)胞外段”定 位在細(xì)胞核中而“細(xì)胞內(nèi)及段跨膜區(qū)”定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。用BLAST軟件 在仇陽(yáng)盯出中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)與之同源的核菩酸序列，但人類基因組（Geallnd 的登錄號(hào)為 ill25408）中包含這段序PI］。分析表明N的 J207可能具有兩 個(gè)啟動(dòng)子和兩種不同的拼接方式，并且廣泛表達(dá)于各種組織
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2001
【分類號(hào)】：Q785

【共引文獻(xiàn)】

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2 伍文星;張俊平;;核糖體蛋白S5的醫(yī)學(xué)研究進(jìn)展[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2011年04期

3 楊帆,劉衛(wèi)平;核糖體蛋白基因及其與人類疾病的研究進(jìn)展[J];臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志;2005年03期

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4 張亞飛;腺病毒介導(dǎo)的RPL23基因轉(zhuǎn)染通過(guò)對(duì)MDM2-p53反饋環(huán)的調(diào)節(jié)抑制p53野生型胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2009年

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3 王海龍;利用酵母雙雜交系統(tǒng)篩選與果蠅smurf相互作用的蛋白[D];華南理工大學(xué);2010年

本文編號(hào)：2692162