【摘要】： 本文應(yīng)用噬斑原位免疫雜交技術(shù)，以AIHA病人血清為探針，從人脾cDNA文庫中篩選與自身免疫性溶血性貧血(autoimmune hemolytic anemia, AIHA)相關(guān)的基因。發(fā)現(xiàn)CD59基因和U1 70kd基因與AIHA有對應(yīng)關(guān)系，并對若干病人的CD59基因的第3和第4外顯子進(jìn)行了測序分析。但是未發(fā)現(xiàn)任何基因突變，推測病人體內(nèi)產(chǎn)生CD59抗體，從而影響了CD59對細(xì)胞的保護(hù)功能。 本文克隆了除信號肽部分以外的CD59 cDNA，并利用大腸桿菌表達(dá)載體pET28b(+)表達(dá)重組人CD59(rhCD59)。我們分離和純化了rhCD59，還對其生物活性作了初步研究，結(jié)果表明rhCD59具有較好的免疫原性，并能保護(hù)細(xì)胞免受補(bǔ)體介導(dǎo)的溶破作用。這為進(jìn)一步探討rhCD59在臨床上的應(yīng)用奠定了較好的基礎(chǔ)。 由于棒狀桿菌生長速度快，無內(nèi)毒素、無胞外蛋白酶，也不會形成包涵體，產(chǎn)品易分離和純化，因此在棒狀桿菌中表達(dá)醫(yī)用rhCD59很有意義。本文在構(gòu)建棒狀桿菌表達(dá)載體的過程中分離到一個新的棒狀桿菌質(zhì)粒pXZ608。該質(zhì)粒全長5949 bp，GC含量為57％，有6個大于300 bp的開放讀碼框(open reading frame，ORF)。其中，ORF1表達(dá)的多肽序列與pIJ101/pJV1滾環(huán)復(fù)制家族的復(fù)制蛋白Rep有一定的同源性，并具有滾環(huán)復(fù)制所需的保守區(qū)域，推測該質(zhì)粒也屬于滾環(huán)復(fù)制家族。通過缺失分析，，2.14 kb BstEII-SacI片段被確定為pXZ608的復(fù)制區(qū)，該復(fù)制區(qū)僅包含ORF1。本文也利用質(zhì)粒pXZ608和大腸桿菌質(zhì)粒構(gòu)建了棒狀桿菌-大腸桿菌穿梭表達(dá)載體，并在棒狀桿菌中成功地表達(dá)了rhCD59，但是表達(dá)量有待進(jìn)一步的提高。
【圖文】：

pXZ608全序列

3. 基因的測序分別以重組子質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)側(cè)翼的T7和SP6啟動子為起點(diǎn), 進(jìn)行雙向測序 序列測定用DNA自動測序儀在上海申友生物工程公司完成 序列如圖4-3, 圖4-4 克隆到pLC21上的DNA共339堿基對 3’末端有58 bp的多聚A 克隆到pLC25上的DNA有960堿基對 無多聚ApLC21:------ caacgc gttggg agctct cccata tggtcg acctgc aggcgg ccgcac tagtgaSacI NdeI SalI PstIttGGTG GCGACG ACTCCT GGAGCC CGAGAA TGGGTA TTTGAT GGAGGC TGCGCC GGAGTGAAGAGG TCGTCC TCTCCA TCTGCT GTGTTT GGACGC GTTCCT GCCCAG CCCCTT GCTGTCAT
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：Q785

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前5條

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本文編號：2689752