【摘要】：抗體廣泛用于疾病治療、醫(yī)療診斷和免疫分離,具有廣闊的市場(chǎng)需求和發(fā)展前景�？贵w主要從動(dòng)物血液、腹水和細(xì)胞培養(yǎng)液中分離得到,尤其是動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)制備單克隆抗體,已實(shí)現(xiàn)規(guī)�；a(chǎn)。然而,目前抗體分離過程的成本仍舊較高,成為抗體產(chǎn)業(yè)發(fā)展的一個(gè)瓶頸,開發(fā)經(jīng)濟(jì)高效的抗體分離新方法,具有重要意義。雙水相萃取具有生物相容性好、分離條件溫和、成本相對(duì)較低、易于放大等優(yōu)點(diǎn),本文針對(duì)含人血清白蛋白(HSA)料液中分離免疫球蛋白G (IgG)和細(xì)胞培養(yǎng)液中分離單克隆抗體兩類典型的抗體分離過程,探討雙水相萃取分離抗體的可行性。主要內(nèi)容如下： (1)從含有HSA的混合蛋白中雙水相萃取分離IgG。比較分析了不同類型雙水相系統(tǒng)中IgG的分配情況,選擇聚乙二醇(PEG)/羥丙基淀粉(HPS)為合適的雙水相系統(tǒng)�？疾炝薖EG濃度、HPS濃度、NaCl濃度和pH對(duì)IgG和HSA在PEG/HPS系統(tǒng)中分配的影響,以IgG上相收率(Ytop)和純化因子(PF)為響應(yīng)值,利用響應(yīng)面法評(píng)價(jià)了四個(gè)因素的顯著性,并優(yōu)化了萃取條件,確定最佳分離條件是12%PEG、18%HPS、10%NaCl和pH8.0, Ytop為99.2%,PF為5.28。進(jìn)一步考察了PEG/磷酸鹽雙水相系統(tǒng)反萃取IgG,確定反萃取最適條件為磷酸鹽(pH7)濃度10%,第一步萃取的上相量與磷酸鹽母液(40%,w/w)的質(zhì)量比為1.6：1。經(jīng)萃取和反萃取兩步分離,IgG收率為84.0%,純化因子為5.73,實(shí)現(xiàn)了從含HSA料液中高效分離IgG。 (2)探討了NaCl對(duì)IgG在雙水相系統(tǒng)中分配和溶解性影響的作用機(jī)制。首先考察了NaCl對(duì)kG分配的影響機(jī)制,發(fā)現(xiàn)添加NaCl造成PEG/HPS雙水相系統(tǒng)相圖的雙節(jié)點(diǎn)曲線向偏離坐標(biāo)原點(diǎn)方向移動(dòng),兩相間的疏水差異性增大；利用熒光法測(cè)定了NaCl對(duì)IgG疏水性的影響,發(fā)現(xiàn)隨著NaCl濃度增大,IgG分子疏水性增大,這正是IgG選擇性分配至上相的主要原因。其次考察了添加NaCl對(duì)IgG溶解性的影響,發(fā)現(xiàn)添加NaCl加劇了IgG在(NH4)2SO4溶液中沉淀析出,卻增大了IgG在PEG溶液中的溶解性,解釋了PEG/(NH4)2SO4和PEG/HPS雙水相系統(tǒng)中IgG收率的差異。進(jìn)一步采用等溫滴定量熱法分析了NaCl對(duì)IgG-PEG間相互作用的影響,發(fā)現(xiàn)隨NaCl濃度增大,IgG-PEG間的相互作用方式發(fā)生了改變,高NaCl濃度下IgG-PEG間疏水相互作用增強(qiáng),明確了添加NaCl增大IgG在PEG溶液中溶解性的內(nèi)在原因,并提出了NaCl影響的可能機(jī)制。 (3)采用兩步雙水相萃取法從中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO)細(xì)胞培養(yǎng)液中分離單克隆抗體MAB�？疾炝薖EG/HPS雙水相系統(tǒng)萃取分離MAB,優(yōu)化了NaCl添加量、pH和料液添加量,確定了最佳條件為12%PEG、18%HPS、15%NaCl、pH6.0和6%CHO細(xì)胞培養(yǎng)液,MAB收率和純度達(dá)96.7%和96.0%。采用PEG/磷酸鹽雙水相系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)反萃取,得到合適的分離條件為系統(tǒng)中磷酸鹽濃度為8%,第一步萃取的上相量與磷酸鹽母液的質(zhì)量比為2.5：1。經(jīng)兩步萃取,MAB收率和純度分別為86.8±1.0%和97.6±0.5%。比較了雙水相萃取和Protein A親和層析,發(fā)現(xiàn)二者得到的MAB純度相近,表明雙水相萃取可作為Protein A親和層析的潛在替代方法,用于從細(xì)胞培養(yǎng)液中高效分離單克隆抗體。 (4)探討了混合模式配基雙水相系統(tǒng)分離抗體的可行性。首先實(shí)現(xiàn)了PEG分子與配基的高效偶聯(lián),制備了系列配基-PEG。采用環(huán)氧氯丙烷法活化PEG,環(huán)氧基接入量可達(dá)到460μmol·g-1PEG;再將活化PEG與配基偶聯(lián),配基接入率達(dá)到90%以上�？疾炝嘶旌夏Ｊ脚浠鶎�(duì)IgG在雙水相系統(tǒng)中分配的影響,包括疏水型配基(MMI-PEG)和荷電配基(MBA-PEG、AHNSA-PEG、MBIA-PEG和MBIS-PEG)。比較分析后發(fā)現(xiàn)巰基咪唑苯甲酸(MBIA)較合適,當(dāng)pH5.0時(shí),添加MBIA-PEG可使IgG富集于上相而大部分HSA分配在下相中。結(jié)果表明,混合模式配基雙水相系統(tǒng)分離IgG具有一定可行性,相關(guān)系統(tǒng)研究還需進(jìn)一步開展。 綜上所述,本文探討了雙水相萃取分離IgG和單克隆抗體,為了提高分離效率,采取了兩個(gè)策略：(1)添加中性鹽,在聚合物／聚合物雙水相系統(tǒng)中添加NaCl,通過影響相平衡和抗體疏水特性,促進(jìn)抗體從下相轉(zhuǎn)移分配入上相；(2)引入混合模式配基,PEG分子與功能配基偶聯(lián),通過配基與抗體發(fā)生相互作用,吸引抗體進(jìn)入上相,實(shí)現(xiàn)與雜蛋白分離。本文證實(shí)了兩種方法的有效性,并分析了相關(guān)機(jī)制,為抗體分離新方法的開發(fā)提供了新思路。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R392;TQ028

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉生杰;周楊;朱茂英;聶傳鵬;李東偉;余為一;;辛酸沉淀-凝膠過濾法提取豬血清IgM[J];阜陽(yáng)師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2007年04期

2 張龍;胡新根;方國(guó)勇;;N-乙酰-L-半胱氨酸修飾的CdTe量子點(diǎn)與人血清白蛋白的相互作用[J];廣東化工;2011年08期

3 魏琪,姚汝華,鮑時(shí)翔;兩種固定化金屬螯合復(fù)合親和膜色譜介質(zhì)制備[J];功能高分子學(xué)報(bào);2000年01期

4 徐長(zhǎng)波;王巍杰;;雙水相萃取技術(shù)研究進(jìn)展[J];化工技術(shù)與開發(fā);2009年05期

5 范杰平;曹婧;孔濤;張璐;;[Bmim]Br-K_2HPO_4雙水相萃取與超聲耦合法提取葛根中的葛根素及其優(yōu)化[J];高�；瘜W(xué)工程學(xué)報(bào);2011年06期

6 王子佳;李紅梅;弓愛君;曹艷秋;苑海濤;;蛋白質(zhì)分離純化方法研究進(jìn)展[J];化學(xué)與生物工程;2009年08期

7 王韌;21世紀(jì)生物化工發(fā)展及對(duì)策[J];化工技術(shù)經(jīng)濟(jì);2000年04期

8 李偉,朱自強(qiáng),梅樂和;雙水相萃取技術(shù)在藥物分離和提取中的應(yīng)用[J];化工進(jìn)展;1998年01期

9 譚平華,林金清,肖春妹,郝三存;雙水相萃取技術(shù)研究進(jìn)展及應(yīng)用[J];化工生產(chǎn)與技術(shù);2003年01期

10 林東強(qiáng),朱自強(qiáng),姚善涇,梅樂和;生化分離過程的新探索──雙水相分配與相關(guān)技術(shù)的集成化[J];化工學(xué)報(bào);2000年01期

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本文編號(hào)：2689570