發(fā)布時間：2020-05-31 03:17

【摘要】：目前，腎臟移植已成為所有終末期腎病(ESRD)患者首選的最理想的腎臟替代療法。而同種異體移植排斥反應仍是目前器官移植領域面臨的最大難題。腎移植面臨的排斥反應，包括超急性排斥反應(HAR)、加速性排斥反應、急性排斥反應(AR)和慢性排斥反應(CR)。其中，急性排斥反應是腎移植術(shù)后的主要并發(fā)癥。另外，它也是導致慢性排斥反應或慢性移植腎病(CAN)、慢性移植物失功的重要的危險因素。急性和慢性排斥反應成為影響器官移植近期和遠期效果的最主要原因。 除了急性和慢性排斥反應，腎移植還要面臨超急性排斥反應和加速性排斥反應的危險，這兩種排斥反應都與免疫高致敏有關(guān)。免疫高致敏患者即患者體內(nèi)預存有較高水平的群體反應性抗體(PRA)。 目前根據(jù)PRA值把患者分為輕度致敏(＜10％)、中度致敏(10％-50％)和高度致敏(＞50％)。高敏患者移植危險性較高，術(shù)中或術(shù)后超急性、加速性、急性、慢性排斥反應的發(fā)生率均較高，往往成為移植的禁忌。由于免疫高敏的分子發(fā)生機制尚不明確，從基因水平研究其病因同時就很重要。 另外，除了排斥反應，免疫抑制劑的長期應用導致移植受者發(fā)生感染、心血管并發(fā)癥、惡性腫瘤、肝臟和腎臟藥物毒性等諸多問題的機會明顯增加。重要的是要在免疫抑制藥物取得療效和發(fā)生風險之間取得平衡，以避免對受者的免疫抑制不足或免疫抑制過度。如果能從基因水平揭示免疫抑制劑的作用靶基因，將為臨床更有效的用藥提供新的理論和實驗依據(jù)。 移植排斥是一個復雜的過程，目前尚未完全認識。為了更好地研究腎移植排斥反應，全面了解同種異體免疫應答的基本過程以及移植后臨床上無排斥反應表現(xiàn)時的免疫應答過程就很必要，也很重要。移植后的免疫應答是一個多基因參與的、非常復雜的過程，T細胞和抗原呈遞細胞(APC)的活化在其中起重要作用。隨著分子免疫學研究的飛速發(fā)展，人們逐漸認識到機體對移植腎的免疫應答及其調(diào)控嚴格受到不同基因的控制。研究認為在T細胞活化過程中，參與激活和表達的基因約有70余種，這些基因按照功能分為三類：細胞原癌基因、細胞因子／細胞因子受體基因以及其他表面分子基因，根據(jù)激活所需時間或表達順序分為三類：即時基因(細胞接受刺激后15-30分鐘表達)、早基因(0.5-24小時表達)和晚基因(數(shù)天內(nèi)表達)。T細胞在排 腎臟移植淋巴細胞免疫相關(guān)基因表達譜研究 第二軍醫(yī)大學博士論文 斥反應過程中的作用機制受多種基因和信號傳導通路調(diào)控，其中涉及淋巴細胞多種基 因的表達變化與調(diào)控。 應用傳統(tǒng)的分子生物學研究方法，無法闡明移植免疫過程中多個基因的復雜作用 機制及其相互作用和調(diào)控關(guān)系。近年來發(fā)展起來的高通量的基因表達分析平臺一一基 囚，芯片于支術(shù)則可以滿足此要求，能夠同時句{究卜千萬個從因的表達情況，為全而了解 基因表達譜變化提供了技術(shù)保證。IiI前，基因芯片技術(shù)已成為生物醫(yī)學研究中的一個 強有力的_上具。與傳統(tǒng)的.{究方法相比，基囚，芯片具有;筒通量、高度平行性、高靈敏 度、高效快速等優(yōu)點。 為此，本實驗應用基因芯片技術(shù)這一目前先進的基因表達分析方法，設計進行了 腎臟移植淋巴細胞免疫相關(guān)基因表達譜研究，包括3部分內(nèi)容。山于移植術(shù)后24小 {付早去L因表達，而到術(shù)后7天，f細胞活化過程中的大部分基因(包括晚基因)已被 激活，，因此實驗的第一、第二兩部分分別動態(tài)檢測腎移植術(shù)后24小時和7天受者外 周血淋巴細胞基因表達譜變化情況，將有助于認識移植免疫的基本過程，并有利于研 究同種移植排斥反應和免疫抑制劑的作用機制。同時研究免疫抑制劑例如甲基強的松 龍(MP)沖擊治療和三聯(lián)免疫抑制治療對受者淋巴細胞免疫相關(guān)基因的影響，了解 其發(fā)揮藥理作用的靶基因，以期對免疫抑制劑的研發(fā)和臨床用藥提供一些新的參考依 據(jù)。實驗的第三部分對免疫高度致敏患者外周血淋巴細胞基因表達譜研究，篩選并分 析差異表達的基因，以期了解免疫高敏相關(guān)基因及其調(diào)控網(wǎng)絡，從基因水平揭示淋巴 細胞在免疫高敏發(fā)生中的分子機制。 總之，木研究應用非侵襲性的方法，通過高通量、高靈敏度的基因芯片技術(shù)，在 體內(nèi)研究腎臟移植淋巴細胞免疫相關(guān)基因表達譜。目前國內(nèi)外尚未見有關(guān)報告。希望 木研究能夠有助于進一步認識移植免疫的基本過程、免疫高致敏的發(fā)生機制，并從而 有助于進一步研究排斥反應的發(fā)生機制和免疫抑制方案。 第一部分 腎移植術(shù)后受者外周血淋巴細胞早反應基因表達的基因芯片研究 目的:研究腎移植術(shù)后受者外周血淋巴細胞早反應基因表達譜變化，了解移植免疫的 基本過程，從基因水平了解淋巴細胞在腎移植免疫反應過程中的作用。同時研究甲基 強的松龍(MP)沖擊治療對移植后淋巴細胞基因表達譜的影響，了解其分子作用機 腎臟移植淋巴細胞免疫相關(guān)基因表達語研究 第二軍醫(yī)大學博士論文 制。方法:取16例腎移植受者移植術(shù)前作為對照組，移植術(shù)后24小時作為實驗組。 每例患者在術(shù)前和術(shù)后24小時分別抽取IOml新鮮血液，分離患者外周血淋巴細胞， 同組標本混合。應用基因芯片技術(shù)，按一步法抽提實驗組和對照組細胞總RNA并純 化mRNA，分別逆轉(zhuǎn)錄合成以Cy3一dUTP和Cys一dUT，標記的cDNA探針
【圖文】：

在一O℃和70℃保溫lh后電泳圖，顯示285條帶無明顯降解。彩圖1一2腎移植受者術(shù)后24h和術(shù)前外周血淋巴細胞樣本雙色熒光標記疊加圖對于某一點的兩種疊加熒光信號，如果cy3信號較強，該點多顯綠色(下調(diào)趨勢):如果Cys信號較強，該點多顯紅色(上調(diào)趨勢):如果強度相似，即顯黃色。彩圖1一3腎移植受者術(shù)后24h和術(shù)前外周血淋巴細胞樣本雜交信號強度散點圖cy3為腎移植受者術(shù)前外周血淋巴細胞的熒光強度，Cys為術(shù)后24h外周血淋巴細胞的熒光強度。x軸、Y軸分別以cy3熒光強度值(一前景值一背景值)和cys熒光強度值為坐標，每一個數(shù)據(jù)點代表芯片上一個基因點的雜交信號:數(shù)據(jù)點若為紅色，則代表丫值與X值的比值在05至2.0之間

馨拖赴鉷庖呦喙鼗餉蟣澩鍥籽行值詼鋮爿醬笱Р┦柯畚?乙萬呂l石呂彩圖1一l腎移植受者術(shù)后24h和術(shù)前外周血淋巴細胞總RNA凝膠電泳圖實驗組和對照組、實驗組’和對照組，分別指在一O℃和70℃保溫lh后電泳圖，顯示285條帶無明顯降解。彩圖1一2腎移植受者術(shù)后24h和術(shù)前外周血淋巴細胞樣本雙色熒光標記疊加圖對于某一點的兩種疊加熒光信號，如果cy3信號較強，該點多顯綠色(下調(diào)趨勢):如果Cys信號較強，該點多顯紅色(上調(diào)趨勢):如果強度相似，即顯黃色。彩圖1一3腎移植受者術(shù)后24h和術(shù)前外周血淋巴細胞樣本雜交信號強度散點圖cy3為腎移植受者術(shù)前外周血淋巴細胞的熒光強度，Cys為術(shù)后24h外周血淋巴細胞的熒光強度。x軸、Y軸分別以cy3熒光強度值(一前景值一背景值)和cys熒光強度值為坐標
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R392

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本文編號：2689195