【摘要】： 腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157 :H7是一類食源性病原體,能引起一些列人類疾病,如腹瀉、出血性腸炎(HC)和溶血性尿毒綜合征(HUS)等,嚴(yán)重癥狀的可導(dǎo)致死亡。EHEC的感染能夠?qū)е翧/E損傷和分泌志賀毒素,目前國內(nèi)外的研究也主要集中在這兩部分。A/E損傷能夠在病原菌粘附宿主細(xì)胞位置形成肌動蛋白聚集的“基座”樣結(jié)構(gòu),并引起與宿主細(xì)胞復(fù)雜的相互作用。我們通過對EHEC緊密粘附素轉(zhuǎn)移受體(Tir)的體外表達(dá)和Tir缺失突變株的構(gòu)建,研究EHEC與宿主細(xì)胞的相互作用,并通過轉(zhuǎn)錄水平的檢測,初步探討其損傷致病機(jī)理。 第一部分EHEC黏附損傷相關(guān)毒力因子Tir、TccP的重組表達(dá)與鑒定 EHEC O157:H7緊密粘附素intimin為病原菌定殖及引起A/E損傷的關(guān)鍵因子,而Tir是病原菌自身編碼的intimin受體蛋白。本實驗在基因工程菌中實現(xiàn)腸出血性大腸桿菌(EHEC)O157:H7緊密黏附素受體(Tir)全分子蛋白的高效表達(dá),并對其生物活性初步分析鑒定。應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)釣取tir基因,構(gòu)建了pET-22b(+)-tir表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)測序鑒定后轉(zhuǎn)化E. coli BL21(DE3),IPTG誘導(dǎo)表達(dá),目的蛋白以裂解上清形式表達(dá),表達(dá)量約10mg/L。經(jīng)鎳柱純化后純度達(dá)90%以上。將FITC標(biāo)記到重組表達(dá)的Tir蛋白上,與HEp-2細(xì)胞相互作用,在熒光顯微鏡下觀察Tir能夠嵌入細(xì)胞膜,說明我們重組制備的蛋白具有生物學(xué)活性,為進(jìn)一步研究Tir與Int281相互作用及其在粘附中作用奠定基礎(chǔ)。 TccP是緊密粘附素受體與細(xì)胞骨架聯(lián)接蛋白。在EHEC中參與A/E損傷的形成,起到類似Nck蛋白的作用。應(yīng)用原核表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建并表達(dá)了TccP蛋白。所得到包涵體形式的TccP蛋白,采用鹽酸胍變性、梯度尿素復(fù)性的方法得到可溶形式的TccP蛋白,純度達(dá)到85%以上。 第二部分Tir、TccP、Int281分子間相互作用及Tir在細(xì)胞粘附中的作用研究Intimin是EHEC外膜蛋白,它在病原菌的粘附過程中起重要作用。Intimn的 受體包括病原菌LEE毒力島編碼的Tir以及宿主自身受體蛋白nucleolin和β1-integrin。已有研究認(rèn)為,intimin與Tir相互作用所產(chǎn)生的信號誘導(dǎo)了A/E損傷的形成。失去了與intimin結(jié)合區(qū)域的Tir蛋白依然能夠嵌入細(xì)胞膜,并能夠使酪氨酸磷酸化,但不能誘導(dǎo)肌動蛋白的聚集。 在這部分工作中,針對EHEC與宿主細(xì)胞相互作用中存在多種受體,我們嘗試分別在分子和細(xì)胞水平闡明受體Tir在EHEC黏附中的作用。首先利用本室前期重組表達(dá)的Int281,通過分子相互作用分析,比較Tir、integrin受體的結(jié)合能力。我們用重組Tir蛋白免疫兔子,制備效價106免疫血清。然后利用ELISA方法驗證Int281與Tir具有結(jié)合活性,且結(jié)合能力大小與蛋白濃度相關(guān)。進(jìn)一步,利用SPR技術(shù),采用氨基耦聯(lián)方式將蛋白Tir耦聯(lián)于CM5芯片表面。利用BIAevalution分析軟件處理數(shù)據(jù),顯示Int281與Tir結(jié)合量,計算出EHEC來源的Int281與Tir親和力常數(shù)為KD: 1.28E-8 (12.8nM),表明Tir是Intimin的特異高親和力受體。利用ELISA原理測定integrin與Int281、TccP與Tir相互作用,發(fā)現(xiàn)過量的integrin與Int281具有結(jié)合活性,而TccP與Tir不具有結(jié)合活性;SPR技術(shù)測定結(jié)果同樣證實:integrin與Int281的結(jié)合活性很弱、而TccP與Tir不發(fā)生直接相互作用,表明宿主細(xì)胞自身的膜蛋白integrin是Intimin的弱親和力受體。 為了進(jìn)一步了解受體Tir在EHEC細(xì)胞粘附中的作用,我們利用Red重組系統(tǒng)構(gòu)建了tir基因缺失突變株,發(fā)現(xiàn)構(gòu)建含有tir基因上、下游各500bp同源臂具有更高的重組效率。在得到tir基因缺失突變株Δtir:EHEC的基礎(chǔ)上,以HEp2細(xì)胞為模型,將不同數(shù)量級的野生型EHEC與Δtir:EHEC分別與細(xì)胞作用,利用平板計數(shù)方法測定粘附到細(xì)胞上菌落數(shù)量。發(fā)現(xiàn)Δtir:EHEC在粘附數(shù)量上均明顯少于野生型EHEC(P0.01)。并且當(dāng)補(bǔ)加重組Tir蛋白(Tir終濃度小于30ng/μl)后,Δtir:EHEC粘附數(shù)量明顯上升(P0.01)。這表明EHEC自身受體Tir做為高親和力受體與宿主提供受體如integrin等相比,在EHEC粘附中起著更重要的作用。 第三部分Tir對A/E損傷細(xì)胞模型相關(guān)基因表達(dá)豐度的影響 EHEC能夠誘導(dǎo)宿主細(xì)胞發(fā)生A/E損傷,它引起宿主細(xì)胞肌動蛋白大規(guī)模的重排,涉及一系列細(xì)胞骨架及其它相關(guān)蛋白。A/E損傷最顯著的特點(diǎn)是在上皮細(xì)胞表面細(xì)菌粘附位置處形成一個上升的“基座”樣結(jié)構(gòu)。Tir是已知的形成A/E損傷關(guān)鍵TTSS效應(yīng)器蛋白,在EHEC中,近來又發(fā)現(xiàn)第二個關(guān)鍵效應(yīng)蛋白,即TccP。EHEC需要TccP來彌補(bǔ)因缺乏相應(yīng)Y474,而導(dǎo)致的不能激活Nck途徑。TccP正是起著類似Nck蛋白的作用。Tir通過其N末端和C末端區(qū)域和許多宿主蛋白相互作用,如α-actinin、talin、vinculin等。這些蛋白通常以直接方式作用于質(zhì)膜磷酸酯層,或以間接方式作用于和質(zhì)膜相聯(lián)系的蛋白,以此聯(lián)系著細(xì)胞膜和骨架蛋白。 在這部分工作中,我們試圖通過在體外細(xì)胞水平上,對發(fā)生由EHEC感染所引起A/E損傷的HeLa細(xì)胞進(jìn)行mRNA水平檢測,并且以我們構(gòu)建的tir缺失突變株Δtir:EHEC同樣感染HeLa細(xì)胞,來探索Tir與宿主細(xì)胞蛋白如肌動蛋白、α-actinin等在轉(zhuǎn)錄水平上的關(guān)系。 我們首先建立EHEC O157感染HeLa細(xì)胞誘發(fā)A/E損傷的模型。用野生型EHEC和Δtir:EHEC分別感染HeLa細(xì)胞,對感染條件進(jìn)行摸索,發(fā)現(xiàn)在106CFU感染劑量以及4小時感染時間內(nèi),A/E損傷特征性“基座”現(xiàn)象最明顯,利用激光共聚焦顯微鏡可觀察野生型EHEC菌株O157 :H7 EDL933對效應(yīng)細(xì)胞造成典型的A/E損傷,肌動蛋白聚集重排;而Δtir:EHEC明顯喪失了致HeLa細(xì)胞A/E損傷的能力。在此細(xì)胞模型基礎(chǔ)上,我們進(jìn)一步通過提取感染后HeLa細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,并以cDNA為模板,利用實時熒光定量PCR技術(shù),檢測α-actin、α-actinin兩個基因mRNA水平上的表達(dá)豐度變化。結(jié)果顯示α-actin、α-actinin兩個基因mRNA水平在兩組感染中均下調(diào)(p0.01)。且α-actin基因mRNA水平在Δtir:EHEC感染組下降趨勢大于野生型EHEC感染組(p0.01)。野生型EHEC感染組α-actinin基因mRNA水平在感染后1小時急劇下降,mRNA相對值小于Δtir:EHEC感染組(p0.01);而1小時之后,EHEC感染組α-actinin基因mRNA水平略有回升,在2小時之后持續(xù)下降,且mRNA相對值大于Δtir:EHEC感染組(p0.01)。結(jié)果顯示在EHEC感染HeLa細(xì)胞過程中,Tir對α-actin和α-actinin基因mRNA表達(dá)水平有影響,相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步研究。 本研究通過對Tir重組表達(dá)及tir基因缺失突變株構(gòu)建,進(jìn)一步了解了Tir蛋白在體外分子、細(xì)胞水平與intimin相互作用以及Tir在EHEC粘附過程中的關(guān)鍵作用,明確了其作為高親和力受體的特性,并且初步發(fā)現(xiàn)Tir對α-actin和α-actinin基因mRNA表達(dá)水平的影響。
【圖文】：

胞平鋪于 6 孔板，細(xì)胞密度為 10各 100μl與Hep2 細(xì)胞 37℃下共同察被標(biāo)記的細(xì)胞。 1686bp 的 tir 基因 裂解菌為模板，調(diào)取 tir 基因。大小為 1686bp 的 tir 與條帶所在回收 PCR 產(chǎn)物，并連入 pEASY tir 基因與 Genbank（GeneID: 960

2. 用 NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切鑒定 pET-22b(+)-tir 質(zhì)為 DL2000 DNA marker，2 泳道為 pET-22b(+)-tir道為雙酶切后的 pET-22b(+)-tir 質(zhì)粒。3 泳道中被酶r 大小與預(yù)期吻合。達(dá)、純化和鑒定ET-22b(+)-tir/BL21 全菌裂解液進(jìn)行 SDS-PA0kD 處明顯有一條蛋白表達(dá)帶，見圖 3，3解液在相應(yīng)位置卻沒有明顯表達(dá)，見圖 3，超聲上清中蛋白含量明顯多于沉淀，見圖 標(biāo)簽的抗體進(jìn)行 Western blotting，用 DAB 顯0kD 處有一條特異條帶，與預(yù)期位置吻合， 親和柱純化帶 6×His 標(biāo)簽的 Tir，經(jīng)薄層掃
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R378

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