【摘要】：【背景】 漢坦病毒感染可引起兩類不同的嚴(yán)重感染性疾病，即腎綜合征出血熱（Hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS）和漢坦病毒肺綜合征（Hantaviruspulmonary syndrome，HPS）。其中HFRS多見于亞洲及東北歐部分地區(qū)，主要由漢灘病毒（Hantaan virus，HTNV）、首爾病毒（Seoul virus，SEOV）和普馬拉病毒（Puumalavirus，PUUV）等引起。我國是世界上HFRS疫情最嚴(yán)重的國家，流行范圍廣，發(fā)病人數(shù)多，病死率較高。HFRS是我國危害最嚴(yán)重的急性傳染病之一。目前我國已研制成功HFRS滅活疫苗，其推廣使用對預(yù)防HFRS的發(fā)生和流行起到了積極作用。但該類疫苗仍存在一些問題，主要是不能有效刺激細(xì)胞免疫應(yīng)答，誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的能力也較弱，抗體滴度不高；此外，目前對于滅活疫苗在制備與使用中的安全性尚存在一些爭議。因此，研發(fā)新型的HFRS疫苗將有助于進(jìn)一步提高我國對HFRS的防控水平。 漢坦病毒基因組包括L、M、S等3個片段，分別編碼病毒的RNA聚合酶、包膜糖蛋白（glycoprotein，GP）Gn、Gc以及核衣殼蛋白（nucleoprotein，NP）。GP和NP都是誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答的主要結(jié)構(gòu)蛋白，其中的Gn及Gc可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，在機(jī)體的保護(hù)性體液免疫應(yīng)答中起主要作用，但其免疫原性較弱，特別是刺激機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力較弱；NP的免疫原性很強(qiáng)，特別是在NP上存在多個CTL表位，在誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答中起主要作用，可有效保護(hù)漢坦病毒對實(shí)驗(yàn)動物的攻擊。因此，同時(shí)應(yīng)用漢坦病毒GP與NP作為重組疫苗的組分有可能達(dá)到優(yōu)勢互補(bǔ)，提高免疫應(yīng)答效果的目的。 本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建了含HTNV S基因0.7kb片段與M基因嵌合基因的一系列原核與真核表達(dá)載體，并進(jìn)行了融合表達(dá)以及基因免疫。結(jié)果表明，嵌合基因表達(dá)的融合蛋白能有效刺激機(jī)體的體液免疫應(yīng)答以及部分細(xì)胞免疫應(yīng)答；在不同的表達(dá)系統(tǒng)中，以重組腺病毒免疫的效果為好，但仍存在融合蛋白的表達(dá)量偏低以及誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答水平尚不理想的問題。針對這些問題，本實(shí)驗(yàn)室正試圖通過對表達(dá)載體進(jìn)行改建，改善目的基因的構(gòu)成，采用不同的表達(dá)方式，聯(lián)合使用不同的分子佐劑等多種策略，來提高目的抗原的表達(dá)量及其誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答的能力，本研究的目的亦在于此。 【方法】 本研究在采用CAG啟動子及HSP70C分子佐劑的基礎(chǔ)上，采取兩條不同的技術(shù)路線，構(gòu)建多株含HTNV不同結(jié)構(gòu)蛋白及其CTL表位、不同組合方式、不同表達(dá)方式的重組腺病毒，并對構(gòu)建的重組腺病毒誘導(dǎo)小鼠體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答的情況進(jìn)行觀察和比較。 （1）考慮到HTNV GP的表位為空間構(gòu)像依賴，將GP與NP融合表達(dá)可能會影響其空間構(gòu)型，從而影響到免疫原性，本研究使用腦心肌炎病毒內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（ECMV IRES）將GP、NP在同一腺病毒中分別表達(dá)，更有利于保持其免疫學(xué)活性。 （2）加入有效的HTNV CTL表位基因（NP127～141aa、NP331～345aa及NP421～429aa，以加間隔序列AAY的方式串聯(lián)），以提高融合蛋白刺激機(jī)體免疫應(yīng)答的能力，特別是提高細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。 【結(jié)果】 第一部分 含HTNV結(jié)構(gòu)基因雙順反子及HSP70C的重組腺病毒的制備及免疫學(xué)特性研究 1．構(gòu)建了可分別表達(dá)HTNV GP、NP及HSP70C的重組腺病毒載體，轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞后，獲得了8株重組腺病毒，分別命名為rAd-GnH-IRES-S0.7H、rAd-GcH-IRES-S0.7H、 rAd-GnH-IRES-S0.7、 rAd-GcH-IRES-S0.7、 rAd-Gn-IRES-S0.7H、rAd-Gc-IRES-S0.7H、rAd-Gn-IRES-S0.7、rAd-Gc-IRES-S0.7。重組腺病毒經(jīng)純化并測定滴度后，以100pfu/cell的病毒量感染HEK293A細(xì)胞，免疫熒光檢測結(jié)果顯示，所有重組腺病毒均可表達(dá)目的蛋白。 2．將上述各重組腺病毒通過腹腔途徑免疫C57BL/6小鼠，以腺病毒空載體、PBS及HFRS滅活疫苗為對照。通過ELISA及微量細(xì)胞培養(yǎng)中和試驗(yàn)對各組小鼠體液免疫應(yīng)答的情況進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，各重組腺病毒均可刺激小鼠產(chǎn)生針對HTNVGP、NP的特異性抗體及中和抗體，且添加HSP70C的各重組腺病毒免疫組抗體的幾何平均滴度（GMT）均高于對應(yīng)的未添加組；在含Gn的各重組腺病毒組中，rAd-GnH-IRES-S0.7H免疫組小鼠血清的抗GP、NP抗體及中和抗體的GMT均為最高，分別為95.1、320.0和30.3；在含Gc的各重組腺病毒組中，rAd-GcH-IRES-S0.7H免疫組小鼠血清的抗GP、NP抗體及中和抗體的GMT均為最高，分別為80.0、380.5和40.0；該兩種重組腺病毒誘導(dǎo)的中和抗體均高于滅活疫苗組（p0.05）。 3．對上述各重組腺病毒免疫小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答情況進(jìn)行了檢測。CTL殺傷實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，融合HSP70C的兩種重組腺病毒（rAd-GnH-IRES-S0.7H和rAd-GcH-IRES-S0.7H）免疫組小鼠的脾細(xì)胞在各效靶比下殺傷效應(yīng)均為最好，且均高于滅活疫苗組（p0.05）。ELISPOT檢測的結(jié)果表明，在各肽池刺激下rAd-GnH-IRES-S0.7H及rAd-GcH-IRES-S0.7H免疫組小鼠脾細(xì)胞的IFN-分泌水平均為最高，且均高于滅活疫苗組（p0.05）。表明融合HSP70C的重組腺病毒能更好的誘導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答。在使用重疊肽段作為刺激物進(jìn)行的ELISPOT實(shí)驗(yàn)中，NP3肽池顯示出了最好的刺激效果，表明HTNV的NP在誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答中的作用比GP更為重要。 4．用HTNV76-118株攻擊各重組腺病毒免疫的小鼠，，采用ELISA及RT-PCR對感染小鼠的部分臟器進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，各重組腺病毒免疫組小鼠臟器中的病毒抗原及病毒核酸量均低于PBS對照組及空載免疫組，其中rAd-GnH-IRES-S0.7H免疫組及rAd-GcH-IRES-S0.7H免疫組小鼠的HTNV抗原及核酸含量均為最低，且與滅活疫苗組無顯著差別（p0.05），表明其保護(hù)效果與滅活疫苗組相當(dāng)。 第二部分 含HTNV嵌合基因、CTL串聯(lián)表位及HSP70C的重組腺病毒的制備及免疫學(xué)特性研究 1．構(gòu)建了含HTNV S基因0.7kb片段與M基因的嵌合基因、CTL串聯(lián)表位及HSP70C的重組腺病毒載體，轉(zhuǎn)染HEK293A細(xì)胞后，獲得了4株重組腺病毒，分別命名為rAd-GnS0.7-CTLH、rAd-GnS0.7-CTL、rAd-GcS0.7-CTLH、rAd-GcS0.7-CTL。重組腺病毒經(jīng)純化并測定滴度后，以100pfu/cell的病毒量感染HEK293A細(xì)胞，免疫熒光檢測結(jié)果顯示，所有重組腺病毒均可表達(dá)目的蛋白。 2．將上述各重組腺病毒通過腹腔途徑免疫C57BL/6小鼠，以腺病毒空載體、PBS及HFRS滅活疫苗為對照。通過ELISA、微量細(xì)胞培養(yǎng)中和試驗(yàn)對各組小鼠體液免疫應(yīng)答的情況進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，各重組腺病毒均可刺激小鼠產(chǎn)生針對HTNVGP、NP的特異性抗體及中和抗體，且添加HSP70C的兩個重組腺病毒免疫組抗體的GMT均高于對應(yīng)的未添加組；其中rAd-GnS0.7-CTLH免疫組小鼠血清的抗GP、NP抗體及中和抗體的GMT分別為80.0、320.0和26.4，均高于rAd-GnS0.7-CTL免疫組；rAd-GcS0.7-CTLH免疫組小鼠血清的抗GP、NP抗體及中和抗體的GMT分別為113.1、452.5和30.3，該兩種重組腺病毒誘導(dǎo)的中和抗體均高于滅活疫苗組（p0.05）。 3．對上述各重組腺病毒免疫小鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答情況進(jìn)行了檢測。CTL殺傷實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，rAd-GnS0.7-CTLH免疫組在各效靶比下，殺傷效應(yīng)均強(qiáng)于rAd-GnS0.7-CTL組，且在效靶比為100:1時(shí)也強(qiáng)于滅活疫苗組（p0.05）；rAd-GcS0.7-CTLH免疫組在各效靶比下，殺傷效應(yīng)均強(qiáng)于rAd-GcS0.7-CTL組，且在效靶比為10:1及100:1時(shí)也強(qiáng)于滅活疫苗組（p0.05）。ELISPOT檢測的結(jié)果表明，在各肽池刺激下rAd-GnS0.7-CTLH及rAd-GcS0.7-CTLH免疫組小鼠脾細(xì)胞的IFN-分泌水平均為最高（p0.05）；rAd-GcS0.7-CTLH免疫組IFN-分泌水平高于滅活疫苗組（p0.05），在除Gn2肽池外的各肽池刺激下rAd-GnS0.7-CTLH組IFN-γ的分泌水平也高于滅活疫苗組（p0.05）。同樣表明融合HSP70C的重組腺病毒能更好的誘導(dǎo)機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答。以本研究所采用的CTL表位序列的三個單獨(dú)的15aa的肽段分別作為刺激物進(jìn)行ELISOPT實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示NP48及NP60肽段的刺激效果最好，表明其包含的CTL表位在誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答中的作用更為突出。 4．用HTNV76-118株攻擊各重組腺病毒免疫后的小鼠，采用ELISA及RT-PCR對感染小鼠的部分臟器進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，各重組腺病毒免疫組小鼠臟器中的病毒抗原及病毒核酸量均低于PBS對照及空載免疫組，其中rAd-GnS0.7-CTLH免疫組及rAd-GcS0.7-CTLH免疫組小鼠的HTNV抗原及核酸含量均為最低，且與滅活疫苗組無顯著差別（p0.05），表明其保護(hù)效果與滅活疫苗組相當(dāng)。 【結(jié)論】 本研究在采用CAG啟動子及HSP70C分子佐劑的基礎(chǔ)上，采取兩條不同的技術(shù)路線進(jìn)一步優(yōu)化了HTNV結(jié)構(gòu)蛋白在重組腺病毒中的表達(dá)，并藉此提高其誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答的效果。一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，采用將HTNV GP和NP分別與HSP70C融合，并用IRES將兩種融合蛋白分別表達(dá)的策略構(gòu)建的重組腺病毒，其誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答和細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力均得到了提升；采用同時(shí)添加CTL串聯(lián)表位及HSP70C的策略構(gòu)建重組腺病毒，也可有效提升其誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答及細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。上述兩種策略構(gòu)建的重組腺病毒誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答在多數(shù)指標(biāo)上均優(yōu)于滅活疫苗或與之相同；相比較而言，前一種策略構(gòu)建的重組腺病毒在誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答方面更具優(yōu)勢，而后一種策略在誘導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答方面更具優(yōu)勢。未來我們將綜合運(yùn)用上述兩種策略，以期獲得更好的免疫保護(hù)效果，為HFRS新型疫苗的研制提供理論、實(shí)驗(yàn)和物質(zhì)基礎(chǔ)。
【圖文】：

圖2 HSP-肽段復(fù)合物與固有免疫及適應(yīng)性免疫(80)SP-peptides complex associated with innate and adaptive im一類界定最為確切的HSP，廣泛分布于各種細(xì)胞中。純效刺激固有免疫應(yīng)答，刺激單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及樹突狀因子(87)。此外，表達(dá)在細(xì)胞表面的HSP70還可作為NK細(xì)性免疫方面，HSP70可與來源于腫瘤、病毒或人工構(gòu)建的多MHC分子，活化抗原特異的CD4+及CD8+T細(xì)胞(89)。此外共刺激分子的表達(dá)(90)。Lehner等(91)對HSP70晶體結(jié)構(gòu)的分彼此分離的結(jié)構(gòu)域，即N端的44 kDa ATPase結(jié)構(gòu)（1～35合結(jié)構(gòu)域（359～494 aa）及10 kDa結(jié)構(gòu)域（495～609 aa）要來源于其C端，N端的ATPase區(qū)域缺乏則此類功能，HSP子、IL-12、TNF-α、NO等，還可促進(jìn)樹突狀細(xì)胞的成熟

12 kb6.0 kb5.0 kb3.0 kb2.0 kb1.5 kb1.0 kb0.5 kb12 kb6.0 kb5.0 kb3.0 kb2.0 kb1.5 kb1.0 kb0.5 kb重組轉(zhuǎn)移載體 pCAG-HSP70C-IRES-S0.7HSP7及 pCAG-HSP70C-IRES-S0.7 酶切鑒定結(jié)果g.5 Restriction enzyme analysis of transfer vectoP70C-IRES-S0.7HSP70C and pCAG-HSP70C-Ide range maker; M2: DL2000 marker; M3: DNA wide ranCAG-HSP70C-IRES-S0.7HSP70C clones (NotⅠ+AflⅡ)2: pCAG-HSP70C-IRES-S0.7 clones (NotⅠ+BstXⅠ).
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R392

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 王海萍;泛素連接酶Hrd1促進(jìn)α1-抗胰蛋白酶Z突變體降解及細(xì)胞存活[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2010年

2 毛愛平;cIAP1/2調(diào)控IFN-β誘導(dǎo)表達(dá)的分子機(jī)制[D];武漢大學(xué);2011年

3 劉婧;湖北地區(qū)漢坦病毒與宿主的基因進(jìn)化研究[D];武漢大學(xué);2011年

4 羅雯;漢坦病毒囊膜糖蛋白G1與核蛋白部分片段在昆蟲細(xì)胞中的融合表達(dá)及免疫學(xué)特性研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2001年

5 張芳琳;漢灘病毒M基因G2片段與S基因0.7Kb片段嵌合基因的表達(dá)及基因免疫的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2001年

6 李新紅;漢灘病毒西安分離毒株84FLi的全基因序列測定與分析及G1和G2糖蛋白桿狀病毒表達(dá)載體的構(gòu)建[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2002年

7 潘蕾;我國疫區(qū)HFRS患者漢灘病毒核蛋白特異性CTL克隆的建立及其初步研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2002年

8 劉勇;漢灘病毒76-118株G1S0.7和G2S0.7不同嵌合基因的表達(dá)及免疫學(xué)特性研究[D];中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué);2003年

9 鄭蘭艷;漢坦病毒核酸疫苗的研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2004年

10 史俊巖;腎綜合征出血熱免疫診斷技術(shù)及其應(yīng)用研究[D];中國醫(yī)科大學(xué);2004年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 任美霞;銀杏提取物對ACS患者外周血單個核細(xì)胞CD40/CD40L炎癥信號傳導(dǎo)的影響[D];浙江大學(xué);2011年

2 王曉捷;氧化應(yīng)激中熱休克蛋白90對20S蛋白酶體功能的影響[D];南方醫(yī)科大學(xué);2011年

3 馬慶慶;HFRS疫苗志愿接種者PBL中CD4~+T、CD8~+T細(xì)胞TCRβ鏈CDR3譜系的監(jiān)測及CDR3分子特征初步分析[D];遵義醫(yī)學(xué)院;2011年

4 趙璐;陸地棉長絨品種魯SO75和短絨品種魯7619纖維發(fā)育特征的研究[D];山東師范大學(xué);2012年

5 韋三華;HFRS患者血清中漢坦病毒RNA的微孔板雜交檢測[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2001年

6 李光玉;漢灘病毒核蛋白羧基端多肽真核、原核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)及初步鑒定[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2002年

7 高娟;熱休克蛋白與漢灘病毒蛋白形成復(fù)合物的研究及該復(fù)合物的誘導(dǎo)表達(dá)[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2004年

8 趙百慧;Ⅰ：沙蠶纖溶酶—沙蠶激酶的克隆、表達(dá)及活性測定 Ⅱ：漢灘病毒截短核蛋白的表達(dá)和初步應(yīng)用[D];青島大學(xué);2004年

9 魏駿飛;漢坦病毒S基因克隆及其在畢赤酵母系統(tǒng)中的表達(dá)[D];天津醫(yī)科大學(xué);2004年

10 閆平男;漢坦病毒核衣殼蛋白基因與EGFP基因在BHK21細(xì)胞中的融合表達(dá)[D];山東大學(xué);2005年

本文編號：2688234