發(fā)布時(shí)間：2020-05-29 20:25

【摘要】：結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)通過氣溶膠方式感染人體后,在肺泡部位增殖引起肺部炎癥,經(jīng)過一個(gè)快速增長(zhǎng)時(shí)期,多數(shù)形成典型的肉芽腫組織病灶。隨著適應(yīng)性細(xì)胞免疫的建立,細(xì)菌不再增殖,而是以潛伏狀態(tài)存在于體內(nèi)。當(dāng)機(jī)體再次受到外來生物或者化學(xué)因素的刺激后,潛伏的細(xì)菌可復(fù)蘇,大量增殖,形成原發(fā)后感染特點(diǎn)。因此多數(shù)學(xué)者認(rèn)為結(jié)核分枝桿菌的休眠狀態(tài)對(duì)應(yīng)于細(xì)菌的持留感染過程是結(jié)核分枝桿菌成功感染人類的重要模式。中國(guó)的結(jié)核病發(fā)病率高居世界第二位,對(duì)于結(jié)核分枝桿菌深入細(xì)致的研究刻不容緩。 數(shù)個(gè)基因可能編碼休眠的重要調(diào)控子稱為休眠存活調(diào)節(jié)子(dormancysurvival regulator,dosR),是通過dosR-dosS二元組分系統(tǒng)的基因調(diào)節(jié)過程發(fā)揮作用。持續(xù)感染時(shí)細(xì)菌的另一個(gè)重要上調(diào)基因種類是毒素-抗毒素(tonxin-antitoxin,TA)基因座,TA基因座產(chǎn)生的毒素被短期存活的抗毒素中和,當(dāng)子細(xì)胞丟失這種攜帶TA基因座的基因時(shí),抗毒素就被降解允許毒素殺死細(xì)菌。TA基因座可以受諸如缺氧、饑餓等環(huán)境因素的上調(diào),啟動(dòng)一個(gè)細(xì)菌的代謝停止,最終促進(jìn)休眠。長(zhǎng)期進(jìn)化過程,MTB還形成了一些適應(yīng)吞噬體內(nèi)增殖的生存策略。包括胞內(nèi)的氧化和硝化應(yīng)激,活性氧和活性氮中間體的解毒,蛋白修復(fù)和降解,DNA修復(fù)、保護(hù)和突變。因此MTB是較為典型的兼性胞內(nèi)寄生菌,也可以作為細(xì)菌慢性感染的一個(gè)重要機(jī)制。 細(xì)菌胞內(nèi)二級(jí)信使環(huán)二鳥苷酸(c-di-GMP)首次在葡萄相關(guān)的木葡糖酸醋桿菌(Acetobacter xylinum)中被鑒定為纖維素合成酶的變構(gòu)刺激子,二鳥苷環(huán)化酶(DGC)和磷酸二酯酶(PDE)為c-di-GMP的合成酶和水解酶。DGC和PDE都包含兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域,分別稱為GGDEF和EAL。系統(tǒng)發(fā)育分布研究顯示編碼GGDEF和EAL結(jié)構(gòu)域的基因在細(xì)菌中廣泛并相對(duì)特異存在,但在真核細(xì)胞或者古細(xì)菌中目前沒有被報(bào)道。胞內(nèi)c-di-GMP的濃度和作用機(jī)制通過多種方式進(jìn)行調(diào)節(jié),能調(diào)控細(xì)菌的細(xì)胞-細(xì)胞間信號(hào)通訊,生物膜形成,運(yùn)動(dòng)性,分化(變異)和毒力等一系列生理過程。但這些結(jié)論多是從快速生長(zhǎng)細(xì)菌中獲得的,在慢生長(zhǎng)菌MTB的具體作用模式仍然不清楚。那么c-di-GMP在MTB中是否也發(fā)揮著重要的生理作用呢?胞內(nèi)c-di-GMP是否能感應(yīng)外界環(huán)境的變化從而啟動(dòng)MTB的休眠? 我們的研究就是試圖闡述c-di-GMP這種二級(jí)信使在Mtb感染過程發(fā)揮的作用。利用生物信息學(xué)方法比對(duì)發(fā)現(xiàn)MTB減毒株H37Ra和毒力株H37Rv中僅含有一個(gè)GGDEF結(jié)構(gòu)域的基因MRA_1362和Rv1354c以及一個(gè)EAL結(jié)構(gòu)域的基因MRA_1365和Rv1357c,而且氨基酸序列完全一致。體外表達(dá)顯示MRA_1362基因編碼產(chǎn)物具有將GTP合成c-di-GMP的功能。隨后我們利用同源重組的原理,建立了MTB的基因敲除體系,將MTBH37Ra中c-di-GMP的合成酶基因敲除(基因編號(hào)分別為MRA_1362),獲得基因敲除株△Ra1362,發(fā)現(xiàn)△Ra1362形成生物膜的速度比野生株更快,而△Ra1365則滯后；轉(zhuǎn)錄譜基因芯片結(jié)果也顯示△Ra1362中部分與休眠相關(guān)的基因表達(dá)水平下調(diào)并能被基因回補(bǔ)和外源添加的c-di-GMP所補(bǔ)償；在快速耗氧模型中,發(fā)現(xiàn)遲緩期過后ARa1362對(duì)氧氣的消耗更快,但胞內(nèi)NAD、NADH能量水平反而下降,推測(cè)該菌以更快的利用氧氣的速度來補(bǔ)償無感應(yīng)狀態(tài)。這些實(shí)驗(yàn)說明MTB依賴c-di-GMP感應(yīng)缺氧或者氧化還原壓力,一方面調(diào)控生物膜的發(fā)育；另一方面合成缺失后在缺氧時(shí)部分dosR調(diào)節(jié)子基因下降表達(dá)。而在毒力株H37Rv中將c-di-GMP降解酶基因Rv1357c敲除后,感染小鼠42天后,跟WT感染組相比,發(fā)現(xiàn)在感染鼠肺組織細(xì)菌的CFU并沒有明顯差異,但組織病理學(xué)顯示敲除株出現(xiàn)的實(shí)質(zhì)性病變較野生型更加明顯,肺重也明顯增大,提示在小鼠內(nèi)的致病性增強(qiáng)。從而推測(cè)體外培養(yǎng)時(shí)隨著細(xì)菌增殖以及胞內(nèi)c-di-GMP濃度增加,感應(yīng)外界環(huán)境中的缺氧壓力,細(xì)菌不易形成生物膜,而感染動(dòng)物時(shí)不易成膜的特性利于細(xì)菌在組織間的擴(kuò)散,從而使細(xì)菌在肺內(nèi)引起更明顯病變,炎癥反應(yīng)加重。該研究首次報(bào)道認(rèn)為在MTB中c-di-GMP可發(fā)揮第二信使功能,體外抑制生物膜發(fā)育,使得細(xì)菌致病性增強(qiáng)。C-di-GMP亦可通過感應(yīng)低氧壓力調(diào)節(jié)部分與休眠有關(guān)基因的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R378.911

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2687453