【摘要】：結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)通過氣溶膠方式感染人體后,在肺泡部位增殖引起肺部炎癥,經(jīng)過一個快速增長時期,多數(shù)形成典型的肉芽腫組織病灶。隨著適應性細胞免疫的建立,細菌不再增殖,而是以潛伏狀態(tài)存在于體內(nèi)。當機體再次受到外來生物或者化學因素的刺激后,潛伏的細菌可復蘇,大量增殖,形成原發(fā)后感染特點。因此多數(shù)學者認為結(jié)核分枝桿菌的休眠狀態(tài)對應于細菌的持留感染過程是結(jié)核分枝桿菌成功感染人類的重要模式。中國的結(jié)核病發(fā)病率高居世界第二位,對于結(jié)核分枝桿菌深入細致的研究刻不容緩。 數(shù)個基因可能編碼休眠的重要調(diào)控子稱為休眠存活調(diào)節(jié)子(dormancysurvival regulator,dosR),是通過dosR-dosS二元組分系統(tǒng)的基因調(diào)節(jié)過程發(fā)揮作用。持續(xù)感染時細菌的另一個重要上調(diào)基因種類是毒素-抗毒素(tonxin-antitoxin,TA)基因座,TA基因座產(chǎn)生的毒素被短期存活的抗毒素中和,當子細胞丟失這種攜帶TA基因座的基因時,抗毒素就被降解允許毒素殺死細菌。TA基因座可以受諸如缺氧、饑餓等環(huán)境因素的上調(diào),啟動一個細菌的代謝停止,最終促進休眠。長期進化過程,MTB還形成了一些適應吞噬體內(nèi)增殖的生存策略。包括胞內(nèi)的氧化和硝化應激,活性氧和活性氮中間體的解毒,蛋白修復和降解,DNA修復、保護和突變。因此MTB是較為典型的兼性胞內(nèi)寄生菌,也可以作為細菌慢性感染的一個重要機制。 細菌胞內(nèi)二級信使環(huán)二鳥苷酸(c-di-GMP)首次在葡萄相關(guān)的木葡糖酸醋桿菌(Acetobacter xylinum)中被鑒定為纖維素合成酶的變構(gòu)刺激子,二鳥苷環(huán)化酶(DGC)和磷酸二酯酶(PDE)為c-di-GMP的合成酶和水解酶。DGC和PDE都包含兩個保守的結(jié)構(gòu)域,分別稱為GGDEF和EAL。系統(tǒng)發(fā)育分布研究顯示編碼GGDEF和EAL結(jié)構(gòu)域的基因在細菌中廣泛并相對特異存在,但在真核細胞或者古細菌中目前沒有被報道。胞內(nèi)c-di-GMP的濃度和作用機制通過多種方式進行調(diào)節(jié),能調(diào)控細菌的細胞-細胞間信號通訊,生物膜形成,運動性,分化(變異)和毒力等一系列生理過程。但這些結(jié)論多是從快速生長細菌中獲得的,在慢生長菌MTB的具體作用模式仍然不清楚。那么c-di-GMP在MTB中是否也發(fā)揮著重要的生理作用呢?胞內(nèi)c-di-GMP是否能感應外界環(huán)境的變化從而啟動MTB的休眠? 我們的研究就是試圖闡述c-di-GMP這種二級信使在Mtb感染過程發(fā)揮的作用。利用生物信息學方法比對發(fā)現(xiàn)MTB減毒株H37Ra和毒力株H37Rv中僅含有一個GGDEF結(jié)構(gòu)域的基因MRA_1362和Rv1354c以及一個EAL結(jié)構(gòu)域的基因MRA_1365和Rv1357c,而且氨基酸序列完全一致。體外表達顯示MRA_1362基因編碼產(chǎn)物具有將GTP合成c-di-GMP的功能。隨后我們利用同源重組的原理,建立了MTB的基因敲除體系,將MTBH37Ra中c-di-GMP的合成酶基因敲除(基因編號分別為MRA_1362),獲得基因敲除株△Ra1362,發(fā)現(xiàn)△Ra1362形成生物膜的速度比野生株更快,而△Ra1365則滯后；轉(zhuǎn)錄譜基因芯片結(jié)果也顯示△Ra1362中部分與休眠相關(guān)的基因表達水平下調(diào)并能被基因回補和外源添加的c-di-GMP所補償；在快速耗氧模型中,發(fā)現(xiàn)遲緩期過后ARa1362對氧氣的消耗更快,但胞內(nèi)NAD、NADH能量水平反而下降,推測該菌以更快的利用氧氣的速度來補償無感應狀態(tài)。這些實驗說明MTB依賴c-di-GMP感應缺氧或者氧化還原壓力,一方面調(diào)控生物膜的發(fā)育；另一方面合成缺失后在缺氧時部分dosR調(diào)節(jié)子基因下降表達。而在毒力株H37Rv中將c-di-GMP降解酶基因Rv1357c敲除后,感染小鼠42天后,跟WT感染組相比,發(fā)現(xiàn)在感染鼠肺組織細菌的CFU并沒有明顯差異,但組織病理學顯示敲除株出現(xiàn)的實質(zhì)性病變較野生型更加明顯,肺重也明顯增大,提示在小鼠內(nèi)的致病性增強。從而推測體外培養(yǎng)時隨著細菌增殖以及胞內(nèi)c-di-GMP濃度增加,感應外界環(huán)境中的缺氧壓力,細菌不易形成生物膜,而感染動物時不易成膜的特性利于細菌在組織間的擴散,從而使細菌在肺內(nèi)引起更明顯病變,炎癥反應加重。該研究首次報道認為在MTB中c-di-GMP可發(fā)揮第二信使功能,體外抑制生物膜發(fā)育,使得細菌致病性增強。C-di-GMP亦可通過感應低氧壓力調(diào)節(jié)部分與休眠有關(guān)基因的表達。
【學位授予單位】：中國科學技術(shù)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R378.911

【共引文獻】

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5 彭琳;成中芹;陳梅;倪鵬平;李蒙英;;一株架橋細菌的共凝集能力及強化生物膜反應器效能的研究[J];環(huán)境科學學報;2014年01期

6 王剛;范立強;程安陽;李小靈;潘忠孝;孟軍;;結(jié)核分枝桿菌RipB基因的克隆、表達及對藤黃微球菌生長的影響[J];華東理工大學學報(自然科學版);2013年04期

7 柯常江;馮起校;李富浩;;結(jié)核病兔模型的建立應用及其研究現(xiàn)狀[J];海南醫(yī)學;2014年03期

8 劉志香;崔紅利;劉正一;王寅初;崔玉琳;劉兆普;秦松;;Transcriptomic analysis of Synechocystis sp. PCC6803 under low-temperature stress[J];Chinese Journal of Oceanology and Limnology;2014年02期

9 孫林;霍如松;李求春;潘志明;焦新安;;結(jié)核分枝桿菌RpfE蛋白的原核表達及鑒定[J];揚州大學學報(農(nóng)業(yè)與生命科學版);2014年01期

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1 閆文娟;c-di-GMP信號通路在變形鏈球菌致齲過程中作用的初步研究[D];第四軍醫(yī)大學;2009年

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本文編號：2687453