【摘要】：背景與研究目的： 組胺是人體組織內的一種廣泛參與免疫反應和誘發(fā)炎癥反應的有機氮化合物,它主要由嗜堿粒細胞和肥大細胞產(chǎn)生。研究表明,在應激條件下,心肌肥大細胞的激活和組織胺的釋放廣泛參與了一系列的心血管疾病的發(fā)生與發(fā)展,例如：心肌缺血再灌注損傷、心律失常、動脈粥樣硬化、糖尿病、慢性心衰,等等。組胺受體1和受體2在心肌和血管內皮中均有表達,它們同屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族,在一系列的細胞信號轉導的過程中起到重要的調節(jié)作用。動物實驗和臨床試驗均表明,組胺受體2的阻斷能改善心肌缺血再灌注損傷和緩解心衰并提高患者的生存率。但是,這種保護作用的機制目前并不十分清楚。組織胺受體2的激活在冠心病當中的機制普遍認為是與β1腎上腺素受體介導的cAMP-PKA信號機制相同,除此之外并無深入的探討和研究。目前的研究已經(jīng)證實組胺受體2的拮抗劑對于神經(jīng)元的凋亡具有保護作用。同時,還有大量的研究表明心肌線粒體功能和血管內皮功能的紊亂在心肌缺血再灌注損傷的病理生理過程中起到至關重要的作用。但是,組織胺受體2的激活對心肌線粒體功能和內皮功能影響的研究并無報道。因此,本研究假設組胺受體2的激活能通過增加心肌線粒體通透性和血管內皮通透性而加重心肌的缺血再灌注損傷。本研究的目的在于探討組織胺受體2的過度激活對小鼠心肌缺血再灌注損傷的影響以及探討其具體的作用機制。 研究方法： 1.病人血清的組胺濃度測定 收集急性心梗病人(AMI≤6d)、不穩(wěn)定性心絞痛病人和健康人全血,用ELISA方法測定血清組胺濃度。 2.細胞分離培養(yǎng)和細胞毒性實驗 分離培養(yǎng)原代SD乳鼠心肌細胞和傳代培養(yǎng)臍靜脈內皮細胞。應用MTT和Hoechst方法檢測不同濃度組胺(0.01-100u M)對心肌細胞存活率和凋亡率的影響。 3.心肌缺血和缺血再灌注損傷模型的建立和處理 11-12周齡C57BL/6雄性小鼠和組胺受體2基因敲除小鼠,體重約25-30g,戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射麻醉。經(jīng)胸骨左側第四肋間開胸,暴露心臟。以8-0尼龍線穿過左心耳下緣1-2mm處的2/3心肌層,短暫結扎或永久結扎左側冠狀動脈,誘導心肌缺血45min后解除結扎使其再灌注24h或永久梗死24h。實驗各分為6組,每組5只,組別為：WT-sham, WT-control, WT-AD, KO-control, WT-fam, WT-fam+AD,組胺受體2特異性阻斷劑fam (famotidine)和特異性激動劑AD (amthamine dihydrobromide)分別于術前30min腹腔注射給藥,術后24h處死存活的小鼠,提取心臟,分別進行western blot、免疫組化和TTC染色。用于蛋白分析的小鼠心臟保存于-80℃；用于免疫組化的小鼠心臟橫切后置于4%多聚甲醛中固定24h再進行脫水和石蠟包埋；用于TTC染色的小鼠心臟先凍于-20度15min,取出后均勻切成5片用TTC染色進行心梗面積分析。 4.基因和蛋白表達分析 提取原代培養(yǎng)的SD乳鼠心肌細胞和傳代培養(yǎng)的臍靜脈內皮細胞的總RNA后再逆轉錄成cDNA,對鼠或人的ANP (atrial natriuretic peptide)、β-MHC (beta-myosin heavy chain)、TNF-α (tunour necrosis factor alpha)、4個組胺受體、(3-actin和GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)進行PCR擴增。 提取原代培養(yǎng)的心肌細胞、臍靜脈內皮細胞和小鼠心肌組織總蛋白或分離原代培養(yǎng)的心肌細胞和小鼠心肌組織線粒體蛋白,應用抗體檢測bax, COX-IV, ERK1/2(extracellular signal-regulated kinase1/2), p-ERK1/2, DAPK-2(death-associated protein kinase2), p-DAPK-2, caspase3, moesin, p-moesin和β-actin的蛋白表達水平并應用Image J進行半定量分析。 將小鼠心臟組織石蠟包埋后切片為5μM厚度,應用抗體檢測心肌組織中MPO (myeloperoxidase)和caspase3的表達水平。 5.心肌細胞線粒體通透性和線粒體去極化檢測 乳鼠心肌細胞分離培養(yǎng)48h后加入1uM濃度的組胺或AD刺激24小時,PBS沖洗3遍后加入1.0mM的鈣黃綠素和1.0mM的氯化鈷置于37度染色20min,然后應用熒光顯微鏡觀察線粒體中綠色熒光的強弱來反映線粒體膜通透性。為了檢測線粒體去極化,加入組胺受體2特異性激動劑AD刺激24小時后,首先應用鈣黃綠素對細胞進行染色,然后應用25nM的MitoTracker對線粒體染色10min,最后熒光顯微鏡下觀察線粒體膜電位的變化。此外,單獨加入25nM的MitoTracker對心肌細胞染色后收集細胞,PBS沖洗5次后在流式細胞計數(shù)儀下記錄心肌細胞當中線粒體膜電位的變化情況。 6.心肌細胞和臍靜脈內皮細胞p-ERK1/2定位分析 加入1μM濃度的組胺刺激乳鼠心肌細胞和臍靜脈內皮細胞24h后,抗體孵育過夜結合細胞中的p-ERK1/2,同時應用DAPI標記心肌細胞的細胞核或應用羅丹明鬼筆環(huán)肽標記內皮細胞的F-actin,再應用熒光顯微鏡對p-ERK進行細胞定位檢測。 7.臍靜脈內皮細胞通透性測量 將臍靜脈內皮細胞傳代接種于Transwell細胞培養(yǎng)皿的上層小室中培養(yǎng)48小時后,加入1μM濃度的組胺刺激,在3h內各個時間點應用電阻測量儀對單層臍靜脈內皮細胞的電阻進行測量和記錄。 結果： 1.急性心梗病人血清組胺濃度增加 ELISA檢測結果顯示急性心梗病人血清組胺濃度高達32.9ng/ml,較不穩(wěn)定性心絞痛和正常人水平明顯升高2倍左右(P0.05),而不穩(wěn)定性心絞痛患者與正常人之間無統(tǒng)計學差異。同時,多元回歸分析結果顯示血清組胺濃度與急性心梗具有相關性(P0.001),而與年齡、性別和藥物治療無相關性。這表明血清中組胺的濃度與急性心梗密切相關。 2.組胺引起心肌細胞的損傷和凋亡 1μM組胺刺激24h后,心肌細胞內ANP, β-MHC的mRNA水平明顯增加。組胺刺激24h后,ANP的蛋白水平亦明顯增高,組胺受體2阻斷劑法莫替丁預處理能阻斷這一現(xiàn)象。MTT和Hoechest分析結果顯示組織胺在0.01μM時對心肌細胞生存和凋亡無明顯影響,但是在0.1-100μM的濃度時能顯著減少心肌細胞的生存率和增加心肌細胞的凋亡(P0.05),提示高濃度的組胺刺激可以誘導心肌細胞凋亡。 3.組胺受體2的激活增加TNF-α的生成和ERK1/2的磷酸化 1gM的AD刺激心肌細胞和臍靜脈內皮細胞24h后,TNF-α的mRNA表達水平明顯增加,組胺受體2阻斷劑法莫替丁能抑制這一現(xiàn)象(P0.05)。此外,在10ng/mL的TNF-α刺激心肌細胞和臍靜脈內皮細胞24h后發(fā)現(xiàn)ERK1/2的磷酸化水平明顯增加(P0.05)。 4.組胺受體2的激活引起心肌細胞凋亡的信號通路與bax、p-ERKl/2、 P-DAPK2和caspase3有關 1μM組胺刺激心肌細胞24h后,心肌細胞胞漿的bax水平明顯增加,法莫替丁預處理能阻斷這一效應。1gM組胺和AD都能增加bax的線粒體轉位,法莫替丁能抑制bax的線粒體轉位現(xiàn)象。由于ERK1/2能調控細胞增值和細胞凋亡,ERK1/2入核啟動了細胞的增值,而胞漿中ERK1/2的聚集可使促凋亡蛋白DAPK2磷酸化水平增高,從而啟動線粒體途徑之外的細胞凋亡。因此我們對ERK1/2和DAPK2的磷酸化狀態(tài)進行了研究。結果顯示組胺受體2的激活上調胞漿中ERK1/2和DAPK2的磷酸化水平,并增加caspase3的表達,這種信號變化被法莫替丁或ERK1/2抑制劑U0126阻斷。 5. ERK1/2在胞漿的聚集增加心肌細胞線粒體膜的通透性和去極化 1gM組胺刺激心肌細胞24h后,熒光顯微鏡觀察結果顯示心肌細胞胞漿當中的p-ERK1/2明顯增加,同時并未發(fā)現(xiàn)p-ERK1/2的核轉移現(xiàn)象。鈣黃綠素和氯化鈷共孵育的結果顯示,組胺和AD刺激24h后的心肌細胞線粒體內鈣黃綠素的綠色熒光較對照組明顯降低,這表明組胺通過組胺受體2增加線粒體膜的通透性,進而使線粒體中的鈣黃綠素溢出到胞漿被氯化鈷淬滅。在培養(yǎng)基中加入組胺受體2阻斷劑法莫替丁或ERK抑制劑U0126抑制線粒體通透轉換孔的開放。鈣黃綠素和MitoTracker雙染的結果以及MitoTracker的流式結果同樣也顯示組胺和AD刺激24h后心肌細胞線粒體膜電位發(fā)生去極化,組胺受體2阻斷和ERK抑制能減輕線粒體膜電位的降低。這些結果表明組胺通過激活組胺受體2增加線粒體膜的通透性和去極化。 6.組胺通過激活組胺受體2增加單層臍靜脈內皮細胞的通透性 與對照組相比,跨膜電阻測量的數(shù)據(jù)顯示1μM組胺刺激臍靜脈內皮細胞3h內,其通透性明顯增加,組胺受體2阻斷劑法莫替丁能逆轉這一效應(P0.05)。免疫印跡顯示1gM的組胺或AD增加臍靜脈內皮細胞ERK1/2和moesin的磷酸化水平,這一改變能被組胺受體2阻斷劑法莫替丁和ERK抑制劑U0126阻斷(P0.05),提示ERK1/2和moesin可能參與了通透性的改變。 7.組胺受體2激活介導小鼠心肌內中性粒細胞浸潤和心肌細胞凋亡 免疫組化檢查發(fā)現(xiàn),與假手術組(WT-sham)相比,在心肌缺血45分鐘再灌注24小時后,對照組(WT-control)小鼠心肌中MPO和caspase3的表達水平明顯上調(P0.05),組胺受體2特異性激動劑AD注射組(WT-AD)心肌中MPO和caspase3的表達水平進一步增高,而組胺受體2阻斷劑法莫替丁腹腔注射組(WT-fam)和組胺受體2基因敲除組(KO-control)心肌組織中的MPO和caspase3的表達水平均較對照組降低(P0.05)。這些結果表明組胺受體2的激活介導了缺血再灌注時心肌的中性粒細胞浸潤和心肌細胞的凋亡。 8.組胺受體2阻斷或敲除減少心梗面積 心肌缺血45min再灌注24h導致野生型小鼠心肌產(chǎn)生15%左右的壞死,而腹腔注射組胺受體2阻斷劑法莫替丁或組胺受體2基因敲除均顯著減少心肌梗死面積(P0.05)。相反,腹腔注射組胺受體2激動劑AD則增加心肌梗死面積至20%左右。同時,在小鼠心肌缺血24小時的動物模型中也觀察到類似的趨勢。此外,心肌缺血45min再灌注24h后心臟組織蛋白免疫印跡結果顯示缺血再灌注能增加ERK1/2和DAPK2的磷酸化水平和增加bax的線粒體表達,而組胺受體2基因敲除能減少它們的表達水平(P0.05)。 結論： 1.急性心梗病人血清中組織胺濃度可高達32.9ng/mL,較正常人和不穩(wěn)定性心絞痛病人顯著增高,提示組胺濃度可作為診斷急性心梗的一個重要的指標。 2.組胺通過激活組胺受體2促進心肌細胞胞漿中bax的線粒體轉位和p-ERK1/2的聚集,分別增加caspase3的釋放和DAPK2的磷酸化水平,從而介導線粒體依賴途徑和非線粒體依賴途徑的心肌細胞的凋亡。 3.組胺通過組胺受體2誘導內皮細胞通透性改變,從而加劇缺血再灌注過程中中性粒細胞的浸潤,其機制與TNF-α、ERK1/2和moesin的激活有關。 4.心肌缺血再灌注的過程中,組胺受體2的激活通過增加心肌細胞線粒體功能和內皮功能的紊亂而加重了缺血再灌注損傷,組胺受體2阻斷劑法莫替丁能減輕心肌的梗死面積,提示組胺受體2阻斷可以作為心肌缺血再灌注損傷的一項新的治療措施。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R363

【共引文獻】

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1 陳強;劉彤;李廣平;;過敏反應致持續(xù)性室性心動過速1例[J];心電圖雜志(電子版);2013年02期

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1 郭斐;酮替芬協(xié)同辛伐他汀對動脈粥樣硬化大鼠血清ox-LDL、hs-CRP、Tryptase的影響[D];南華大學;2013年

2 鄭q諉，

本文編號：2687124