【摘要】：第一部分：大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定 目的：建立一套簡單高效，重復(fù)性好的體外分離培養(yǎng)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的方法，為陰道組織工程的研究作準(zhǔn)備。 方法：全骨髓貼壁培養(yǎng)法培養(yǎng)MSCs。分離大鼠雙側(cè)脛、股骨，剪去兩側(cè)骨骺端，無菌條件下用DMEM/F12培養(yǎng)基沖洗骨髓腔。獲得的細(xì)胞懸液移入離心管200g，5min離心。棄上清，DMEM/F12完全培養(yǎng)基重懸，70μm細(xì)胞篩過濾細(xì)胞懸液，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為7.5×107/ml，以1.5×107個/cm~2密度鋪于25cm~2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，即每瓶5ml。置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48小時首次半量換液，之后3-4天換液一次。待細(xì)胞70%-80%融合時使用胰蛋白酶消化傳代。棄去培養(yǎng)液，37℃預(yù)熱的PBS液沖洗約2-3次，加入0.5ml胰蛋白酶溶液，25℃消化約2min，加入DMEM/F12完全培養(yǎng)基終止消化。彎頭吸管沿瓶底輕輕吹打，收集細(xì)胞懸液，以1×104個/cm~2的密度接種于新的培養(yǎng)瓶內(nèi)進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。MTT法評價第1至5代細(xì)胞增殖情況。經(jīng)傳代純化后第三至五代MSCs使用流式細(xì)胞學(xué)分析CD29，CD90及CD45表達(dá)。成骨成脂誘導(dǎo)鑒定MSCs的多向分化能力。成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)14天后，按照試劑盒說明做堿性磷酸酶（ALP）活力測定，不溶的紅色顆粒沉淀指示ALP的活性位點。誘導(dǎo)21-28天時，用茜素紅染色評價大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的礦化能力。成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)14天后油紅O染色確定是否有脂滴生成。 結(jié)果：原代培養(yǎng)7-10天左右細(xì)胞呈集落生長，逐漸融合成片，融合約70%-80%，可傳代培養(yǎng)。傳代活細(xì)胞24h完全貼壁生長。傳代后細(xì)胞生長更快，三至五天后細(xì)胞即可融合，呈梭形漩渦樣生長，可再次傳代。傳代MSCs在接種第1-2天為細(xì)胞適應(yīng)期，第3-4天進(jìn)入對數(shù)生長期。第5天后曲線逐漸變得平緩，細(xì)胞增殖明顯減慢，進(jìn)入平臺期。MSCs經(jīng)流式細(xì)胞分析高表達(dá)CD29，CD90，陽性率分別為99.91%、99.95%；而CD45呈陰性，陽性率為0.03%。成骨分化誘導(dǎo)2周后ALP活性增高，4周后茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色陽性。成脂分化誘導(dǎo)2周后細(xì)胞中出現(xiàn)油紅O染色陽性的脂滴。 結(jié)論：使用全骨髓貼壁培養(yǎng)法可以獲得高純度，具有多向分化能力的MSCs。 第二部分：大鼠陰道上皮細(xì)胞原代培養(yǎng)方法的改進(jìn) 目的：探討大鼠陰道上皮細(xì)胞(VECs)體外培養(yǎng)的影響因素，對現(xiàn)有的VECs體外分離培養(yǎng)方法進(jìn)行改進(jìn)，建立大鼠陰道上皮細(xì)胞穩(wěn)定的體外分離培養(yǎng)方法以用于組織工程。 方法：酶消化法分離消化大鼠陰道上皮細(xì)胞。取陰道全層組織，修剪成1×0.5cm大小，移入超凈臺。組織塊經(jīng)4℃PBS清洗液徹底清洗6遍，加入中性蛋白酶Ⅱ型（DispaseⅡ），放4℃冰箱過夜消化18h。取出后經(jīng)PBS沖洗，分離上皮層。上皮層加入0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA后37℃消化。輕輕吹打，DMEM/F12完全培養(yǎng)基終止消化，吸管吹打成單細(xì)胞懸液，200g，5min離心，KBM完全培養(yǎng)液重懸，細(xì)胞計數(shù)板計活細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞懸液以1.0×105個/cm~2的密度接種于培養(yǎng)板中，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。第2天首次換液，以后每兩天換液一次。在此方法基礎(chǔ)上比較大鼠不同動情周期（動情前期，動情期，動情后期），不同DispaseⅡ配置（PBS配置與KBM配制），不同DispaseⅡ濃度（0.6U/ml與1.2U/ml），不同胰蛋白酶消化方法（30min消化一次與10min重復(fù)3次），培養(yǎng)表面不同處理（FN/C包被及去離子水包被），不同培養(yǎng)基（KBM培養(yǎng)基與含6%FBS的KBM培養(yǎng)基）對大鼠陰道上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響，對上皮分離的結(jié)果進(jìn)行評分，并觀察48h首次換液時細(xì)胞貼壁情況。免疫細(xì)胞化學(xué)染色及免疫熒光檢測廣譜角蛋白AE1/AE3表達(dá)。掃描電鏡觀察細(xì)胞表面超微結(jié)構(gòu)。 結(jié)果：動情前期的大鼠陰道上皮層消化后可獲得更多大鼠陰道上皮細(xì)胞（P=0.0346）；上皮層用KBM配制的DispaseⅡ消化后48h貼壁細(xì)胞多于用PBS配制的DispaseⅡ；1.2U/mlDispaseⅡ的分離結(jié)果評分及可獲活細(xì)胞數(shù)高于0.6U/mlDispaseⅡ（P=0.025; P=0.034）；三步胰酶消化方法相比一步胰酶消化方法可獲得更多的貼壁細(xì)胞；FN/C包被液處理的培養(yǎng)表面相比去離子水可以獲得更多的貼壁細(xì)胞；大鼠陰道上皮細(xì)胞在含血清培養(yǎng)基中生長快，但易受成纖維細(xì)胞污染。經(jīng)改良方法培養(yǎng)的VECs免疫細(xì)胞化學(xué)染色及免疫熒光顯示廣譜角蛋白AE1/AE3陽性。掃描電鏡顯示VECs呈鑲嵌排列，細(xì)胞之間界限清晰，表面可見褶曲和微絨毛，呈不規(guī)則疏網(wǎng)狀。 結(jié)論：使用改良的原代培養(yǎng)方法可獲得更多的大鼠陰道上皮細(xì)胞，細(xì)胞顯示上皮細(xì)胞特征。 第三部分：大鼠陰道上皮細(xì)胞誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向上皮細(xì)胞的分化 目的：探索體外誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）向上皮細(xì)胞分化的可行性。 方法：將陰道上皮細(xì)胞(VECs)鋪于事先包被FN/C的0.4μm Transwellinsert共培養(yǎng)小室內(nèi)，與鋪有MSCs的6孔板建立間接共培養(yǎng)體系，誘導(dǎo)MSCs向上皮細(xì)胞分化。分別于0天、7天及14天時，移去小室，倒置顯微鏡下觀察MSCs的形態(tài)變化。細(xì)胞爬片使用免疫細(xì)胞化學(xué)染色對誘導(dǎo)后的MSCs進(jìn)行上皮細(xì)胞標(biāo)志物廣譜角蛋白AE1/AE3的檢測。VECs和MSCs分別用作陽性及陰性對照。Western Blot檢測上皮細(xì)胞標(biāo)志物廣譜角蛋白AE1/AE3的表達(dá)水平。GAPDH用作內(nèi)參照物。 結(jié)果：MSCs與VECs共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化7天時，MSCs的形態(tài)由0天時長梭形開始變?yōu)樯掀拥亩噙呅�。共培養(yǎng)14天時，更多MSCs變?yōu)槎噙呅�。免疫�?xì)胞化學(xué)染色表明經(jīng)誘導(dǎo)7天及14天的MSCs廣譜角蛋白AE1/AE3表達(dá)陽性；Western blot檢測誘導(dǎo)后的MSCs表達(dá)AE1/AE3，誘導(dǎo)7天組AE1/AE3的蛋白水平高于0天組（36.28±1.49vs.1.00±0.00，P0.01），誘導(dǎo)14天組AE1/AE3的蛋白水平高于0天組（48.80±3.17vs.1.00±0.00，P0.01）及7天組（48.80±3.17vs.36.28±1.49，P=0.0232）。 結(jié)論：VECs可以通過間接共培養(yǎng)的方式誘導(dǎo)MSCs向上皮細(xì)胞分化，上皮細(xì)胞標(biāo)志物廣譜角蛋白AE1/AE3的表達(dá)量隨時間延長而增高。 第四部分：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向上皮細(xì)胞分化中Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控作用 目的：探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）向上皮細(xì)胞分化過程中Wnt/β-catenin信號通路的可能作用。 方法： MSCs和VECs間接共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化。分別于0天、7天及14天時，，使用Western Blot對誘導(dǎo)后的MSCs及VECs進(jìn)行Wnt/β-catenin信號通路的重要成分β-catenin，GSK-3β，pi-GSK-3β，TCF-3表達(dá)水平的測定。為研究Wnt信號通路在MSCs向上皮細(xì)胞分化中的調(diào)控作用，分三組進(jìn)行MSCs和VECs的間接共培養(yǎng)誘導(dǎo)：(1)對照組加入含3%FBS的KBM培養(yǎng)液；(2) Wnt通路激動劑組加入含20μM氯化鋰（LiCl）的3%FBS-KBM培養(yǎng)液；(3) Wnt通路抑制劑組加入含20ng/ml Dickkopf-1（DKK-1）的3%FBS-KBM培養(yǎng)液。于共培養(yǎng)第7天移去培養(yǎng)小室，使用Western Blot對誘導(dǎo)后的MSCs進(jìn)行Wnt/β-catenin信號通路的重要成分β-catenin，GSK-3β，TCF-3及廣譜角蛋白AE1/AE3的表達(dá)水平測定。GAPDH用作內(nèi)參照物。 結(jié)果：MSCs與VECs共培養(yǎng)7天時，Western blot檢測誘導(dǎo)后的MSCs其β-catenin (1.50±0.11vs.1.00±0.00, P=0.009), pi-GSK-3β (1.50±0.23vs.1.00±0.00, P=0.09)及TCF-3(1.25±0.16vs.1.00±0.00, P=0.19)的表達(dá)量逐漸增加，GSK-3β的表達(dá)量(0.69±0.04vs.1.00±0.00, P=0.002)逐漸減少。共培養(yǎng)14天與共培養(yǎng)7天相比，β-catenin (1.85±0.23vs.1.50±0.11,P=0.24)與pi-GSK-3β (2.31±0.33vs1.50±0.23, P=0.114)的表達(dá)水平增高，GSK-3β (0.34±0.03vs.0.69±0.04, P=0.0021)及TCF-3(0.98±0.17vs.1.25±0.16, P=0.3144)的表達(dá)水平下降。GSK-3β的表達(dá)與β-catenin呈現(xiàn)出相反的趨勢。pi-GSK-3β的表達(dá)與GSK-3β也呈現(xiàn)出相反的趨勢。誘導(dǎo)7天時，20μM LiCl組β-catenin (1.24±0.07vs.1.00±0.00, P=0.02)，TCF-3(2.15±0.24vs.1.00±0.00, P=0.14)表達(dá)增加， GSK-3β(0.60±0.07vs.1.00±0.00, P0.01)表達(dá)減少；20ng/ml DKK-1組β-catenin(0.92±0.08vs.1.00±0.00, P=0.38)，TCF-3(0.77±0.09vs.1.00±0.00, P=0.06)表達(dá)減少，GSK-3β (1.11±0.03vs.1.00±0.00, P=0.02)表達(dá)增加。檢測AE1/AE3的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)相比對照組，LiCl可以增加AE1/AE3的表達(dá)水平(1.20±0.18vs.1.00±0.00, P=0.32)，而DKK-1則降低AE1/AE3的表達(dá)(0.83±0.11vs.1.00±0.00, P=0.19)。 結(jié)論：Wnt/β-catenin信號通路可能參與調(diào)控VECs誘導(dǎo)MSCs向上皮細(xì)胞分化的過程，使用LiCl激活Wnt/β-catenin信號通路可以加速分化。
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329

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本文編號：2684417