發(fā)布時間：2020-05-27 21:12

【摘要】：本論文主要涉及計算化學方法開發(fā)及在生物科學中的應用。研究主要包括兩個方面：通過分子動力學模擬的方法對蛋白化學交聯(lián)結果進行預測和驗證；通過計算模擬和蛋白-蛋白分子對接,以及化學交聯(lián)等實驗方法對抗糖尿病藥物靶點PPARy小分子配體抑制CDK5/p25介導的PPARy磷酸化修飾的作用機理研究。 基于質譜的蛋白化學交聯(lián)多肽鑒定技術是利用小分子將蛋白上特定殘基進行共價交聯(lián)后再通過生物質譜鑒定出被交聯(lián)的多肽序列,從而得到這些殘基對在三維結構上的空間距離信息,該方法已經被廣泛應用于蛋白-蛋白結合方式及蛋白結構預測研究中。雖然目前已經有多種預測蛋白中可交聯(lián)殘基對的計算方法,但仍然存在一定的問題,因此我們開發(fā)了一種基于分子動力學模擬的新的計算預測方法(XLMD)。該方法不同于其他僅單純考慮空間幾何關系的預測方法,通過外加拉力作用于交聯(lián)劑和可修飾的殘基對,來模擬交聯(lián)劑和蛋白之間的相互作用,是目前唯一可以同時考慮蛋白主鏈和交聯(lián)劑自身合理構象變化的方法。我們以文獻報道的蛋白交聯(lián)數(shù)據(jù)為訓練集對XLMD中的關鍵參數(shù)進行了系統(tǒng)的優(yōu)化,并用優(yōu)化后的參數(shù)在另外一些蛋白上進行了測試,測試結果顯示,XLMD假陽性率比已有的Xwalk和Rosetta預測方法降低了約一半。此外,我們與質譜實驗室合作,對兩個更為復雜的蛋白進行了質譜交聯(lián)鑒定和計算預測。我們發(fā)現(xiàn)雖然XLMD和Xwalk的預測中均新出現(xiàn)了一定的假陰性預測,但XLMD的假陽性預測數(shù)目仍然比Xwalk少一半以上,并且.與之前提到的相對簡單的蛋白相比XLMD的假陽性率沒有增加,說明基于物理學基礎的XLMD方法是一種更加穩(wěn)定,可以普遍適用并且成功率更高的蛋白可交聯(lián)殘基對的預測方法。而且,通過利用更精確的物理模型和模擬方法,XLMD方法具有進一步優(yōu)化和提高的潛力。 PPARy小分子配體是一類廣泛使用的糖尿病治療藥物,傳統(tǒng)認為的作用機制是作為激動劑來調控PPARy的轉錄活性。但近年來研究發(fā)現(xiàn)其配體還可以抑制CDK5/p25激酶對PPARy特定絲氨酸的磷酸化,臨床數(shù)據(jù)顯示該磷酸化修飾與胰島素抵抗密切相關,因此PPARy配體的新作用機制具有極大的臨床應用價值。目前,PPARy小分子配體如何抑制磷酸化的分子機理仍不清楚,因此我們結合計算模擬和實驗的方法對該機制進行了初步探討。首先,對比不同配體結合下的PPARy構象發(fā)現(xiàn),配體結合并沒有引起PPARy被催化絲氨酸所在區(qū)域明顯的構象變化；但通過分子動力學模擬的方法,我們發(fā)現(xiàn)不同類型的配體對該區(qū)域有不同程度的穩(wěn)定作用。其次,為了進一步研究配體是如何影響PPARy與CDK5/p25的結合,我們一方面采用蛋白-蛋白分子對接的方法對PPARy-CDK5/p25蛋白復合物的構象進行了全局剛性搜索和局部柔性搜索,篩選出了比較合理的結合方式；另一方面與質譜實驗室合作,對復合物進行了化學交聯(lián)和質譜鑒定,綜合多次鑒定結果分析出了6對PPARy與CDK5之間可信的交聯(lián)殘基對。然而從結構上分析發(fā)現(xiàn)這6個交聯(lián)對之間并不完全兼容,并且有些與發(fā)生磷酸化反應所要求的構象也不兼容,說明很可能該復合物不是唯一構象。我們進一步通過凝膠過濾層析,ITC和SPR的實驗方法發(fā)現(xiàn)它們的相互作用較弱,沒有形成均一穩(wěn)定的復合物,再次暗示了多種結合方式同時存在的可能性。我們用開發(fā)的XLMD方法和質譜的鑒定結果對之前蛋白對接并篩選出的復合物構象做了進一步的分析,并最終得到實驗及理論上都比較合理的PPARy-CDK5/p25結合模式。該部分得到以下結果與結論：PPARy配體沒有改變該蛋白的優(yōu)勢構象,但可以穩(wěn)定被催化位點附近區(qū)域；PPARy與CDK5/p25的相互作用非常弱并且可能有多種結合方式；我們篩選并通過交聯(lián)質譜和計算的方法驗證了兩種可能的構象,并基于這兩種構象分析了蛋白結合過程的關鍵因素。論文所得結果可以被用來進一步設計實驗和計算方案以研究PPARy配體對PPARy-CDK5/p25復合物結合的影響。
【學位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R587.1;R3411

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