【摘要】：結(jié)核病(tuberculosis, TB)是嚴(yán)重危害人類健康的傳染性疾病。WHO的統(tǒng)計(jì)數(shù)字顯示,2011年全球共有新發(fā)結(jié)核病例數(shù)870萬,包括31萬耐多藥結(jié)核病例(Multi-drug resistant tuberculosis, MDR-TB),因結(jié)核病死亡的病例數(shù)高達(dá)140萬。中國是22個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一,病例總數(shù)居全球第二,耐藥病例數(shù)世界第一。結(jié)核分枝桿菌北京型家族菌株(下稱北京菌株)是我國結(jié)核病的主要致病菌,該菌株大多分布于東南亞地區(qū),但隨著亞洲人口的遷移,北京菌株已遍布全球,是一百多年來擴(kuò)張最快的結(jié)核菌家族。 課題組前期通過復(fù)制、重組、修復(fù)相關(guān)的3R基因(Replication, Recombination, and Repair)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(Single Nucleotide Polymorphism, SNPs)分型技術(shù),將北京菌株進(jìn)一步細(xì)分為7種亞型,并發(fā)現(xiàn)最近分化(5,000-6,000年前)的Bmyc10亞型在我國人群中的分布占主要地位(約80%),而種系發(fā)生關(guān)系上與之相鄰的Bmyc26亞型在人群中的比例不足1%。這兩個種系關(guān)系相近的結(jié)核菌亞型為什么會出現(xiàn)如此懸殊的流行差異,是本論文研究的第一個問題。 為了揭示Bmyc10菌株在人群中廣泛分布的分子機(jī)制,我們根據(jù)全國6縣級地區(qū)1448株結(jié)核菌的3R基因SNPs以及16位點(diǎn)數(shù)目可變串聯(lián)重復(fù)序列(Variable Number of Tandem Repeats, VNTR)基因分型結(jié)果,挑選了35株代表5種北京菌株亞型的臨床菌株用作高通量全基因組測序。聯(lián)合4株在全球范圍發(fā)現(xiàn)并已公布基因組序列的北京菌株和結(jié)核菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv,我們構(gòu)建了北京菌株各亞型的種系關(guān)系發(fā)生樹,以此鑒定Bmyc10亞型特異的SNPs位點(diǎn)和插入缺失序列(Insertions and Deletions, Indels)。種系發(fā)生樹的結(jié)構(gòu)顯示,目前引起廣泛關(guān)注的北京菌株均屬于Bmyc10亞型。對該亞型突變基因的功能相似性分析結(jié)果提示,這些基因在細(xì)胞定位上偏好于細(xì)胞膜和細(xì)胞壁等與宿主頻繁接觸的區(qū)域。通過位點(diǎn)保守性、正選擇分析等方法,我們鑒定出11處可能對基因功能有重要影響的遺傳突變。參考結(jié)核菌在134種應(yīng)激條件下的轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù),我們發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)這些突變基因上調(diào)的應(yīng)激條件為自由脂肪酸以及反應(yīng)氧/氮化合物損傷,這與結(jié)核菌在宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存環(huán)境十分相似。因此,我們的分析結(jié)果提示,Bmyc10亞型特異的遺傳突變很可能以多個突變基因協(xié)同作用的方式,增強(qiáng)了該亞型菌株對宿主巨噬細(xì)胞內(nèi)應(yīng)激條件的適應(yīng)性。這些適應(yīng)性突變的積累,為此后Bmyc10亞型的擴(kuò)張奠定了重要的遺傳基礎(chǔ)。 流行病學(xué)研究提示,耐多藥結(jié)核病的產(chǎn)生與傳播是結(jié)核病在某些地區(qū)廣泛流行的主要原因,然而,結(jié)核菌獲得性耐藥的形成機(jī)制目前尚不清楚。在本論文的第二章,我們將研究方向轉(zhuǎn)向了Bmyc10菌株在臨床治療過程中的微進(jìn)化過程,其中結(jié)核菌獲得性耐藥的形成過程是我們重點(diǎn)研究的問題。 為了研究在治療壓力下,結(jié)核菌從全敏感發(fā)展為耐多藥結(jié)核的微進(jìn)化過程,我們從上海疾病預(yù)防控制中心(下稱上海疾控中心)選取了3例結(jié)核病患者的7份痰菌樣本作全基因組測序。經(jīng)過以似然比檢驗(yàn)(Likelihood Ratio Test, LRT)為核心的分析流程,我們發(fā)現(xiàn)每例測序樣本具有8-41處頻率大于5%的不固定突變,提示體內(nèi)的結(jié)核菌群體具有豐富的遺傳多樣性。接著,在對耐藥相關(guān)基因更為細(xì)致的分析中,我們發(fā)現(xiàn)多達(dá)4-5種耐藥突變在耐藥形成過程中被篩選,這說明結(jié)核菌有能力選擇多種耐藥突變應(yīng)對多藥聯(lián)用的抗結(jié)核治療方案。最終,隨著治療的持續(xù)進(jìn)行,只有一種耐藥突變被保留,提示不同的耐藥菌亞群之間存在相互競爭(克隆干擾)的關(guān)系。結(jié)核菌克隆干擾的發(fā)現(xiàn),強(qiáng)調(diào)了早期診斷、及時治療對預(yù)防獲得性耐藥的重要意義。此外,我們還發(fā)現(xiàn)了19處在治療過程中頻率發(fā)生顯著變化的基因組突變,其中的14處突變可能增強(qiáng)了耐藥結(jié)核菌對體內(nèi)環(huán)境的適應(yīng)能力。 結(jié)核菌體內(nèi)遺傳多樣性的發(fā)現(xiàn),對其適應(yīng)性進(jìn)化的理論研究具有重要意義,然而,這一發(fā)現(xiàn)的臨床應(yīng)用價值仍有待探索。第二章的研究中,我們發(fā)現(xiàn)有效的治療方案,使痰菌樣本中的特征性突變減少,而當(dāng)治療方案無效時,高通量測序檢測到的突變數(shù)量增加,這提示痰菌樣本的遺傳多樣性可能與結(jié)核病患者的療效相關(guān)。隨著測序成本的不斷下降,全基因組測序有望替代當(dāng)前的痰液檢測手段,成為指導(dǎo)臨床用藥,監(jiān)測治療效果的常規(guī)檢驗(yàn)方法。定量監(jiān)測結(jié)核菌遺傳多樣性變化并探索與治療轉(zhuǎn)歸的聯(lián)系,因此成為第三章研究的重點(diǎn)問題。 為了初步探討治療效果與痰菌樣本遺傳多樣性的聯(lián)系,我們從河南省胸科醫(yī)院的菌種庫中選取了1例耐多藥復(fù)治病例在治療前,以及治療后第2、4、6、8、16周的痰菌樣本,并對這些樣本進(jìn)行了1,000倍以上的高深度測序。治療記錄顯示,在藥敏測試結(jié)果不詳?shù)那?周里,患者接受了無效的治療方案,而第5周后二線抗結(jié)核藥阿米卡星的應(yīng)用,使痰液菌載量略為下降。與此相應(yīng),我們在治療前4周的3例痰菌樣本中發(fā)現(xiàn)特征性突變從33持續(xù)上升至50SNPs/103倍測序深度,而第6周的樣本中,突變數(shù)量又驟降至25SNPs/103倍測序深度,下降趨勢一直延續(xù)至第16周。這一結(jié)果提示,“治療無效,多樣性上升；治療有效,多樣性下降”的科學(xué)假設(shè)很可能是成立的。接著,通過鑒定治療過程中頻率發(fā)生顯著性變化的基因組突變,我們發(fā)現(xiàn)僅有一處同義突變的頻率持續(xù)上升。雖然沒有改變蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu),但該突變使編碼天冬氨酸密碼子的偏好性提升了2倍,說明同義突變可能通過改變密碼子使用偏好性影響了突變蛋白的表達(dá)水平。最后,我們發(fā)現(xiàn)阿米卡星主要的殺菌效應(yīng)只維持了不到1周的時間。由于治療期間并沒有阿米卡星耐藥相關(guān)突變出現(xiàn),我們推測結(jié)核菌的表型耐藥是治療失敗的主要原因。這一結(jié)果提示,高通量技術(shù)也可以用于結(jié)核菌表型耐藥的檢測和評估,為將來的個性化治療提供用藥指導(dǎo)。 綜上所述,本論文通過高通量測序技術(shù),研究了北京菌株Bmyc10亞型在不同時空尺度下的進(jìn)化過程。通過對痰菌樣本遺傳多樣性的定量監(jiān)測,我們還初步探討了高通量測序?qū)χ笇?dǎo)用藥,評估療效的可行性。本研究的結(jié)論不僅對結(jié)核菌微進(jìn)化的理論研究有參考價值,也有望為高通量測序技術(shù)的臨床應(yīng)用指出一條新的方向。
【圖文】：

圖2 1ndels鑒定方案示意圖。A)本研究中用于鑒定Indels的兩種方案。方案一從短片段測序序列與模板的匹配信息中提取Indels信息；方案二通過不依賴模板的從頭拼接得到長片段Contigs,并通過序列的對位排列鑒定Indels位置和大小。B) Contigs序列和模板對位排列的幾種結(jié)果。實(shí)線代表連續(xù)的匹配結(jié)果，虛線代表不連續(xù)的匹配結(jié)果。當(dāng)匹配結(jié)果中Contigs序列連續(xù)，而模板序列不連續(xù)時，或者Contigs和模板的匹配結(jié)果均不連續(xù)，但Contigs間隔區(qū)間較長時，提示測序樣本在該處有片段缺失。反之則提示樣本中有片段插入。對經(jīng)過以上兩種方案處理后的文件編寫R腳本，根據(jù)樣本所屬的北京菌株亞型，整合Indels信息，并用Hsher確切概率法對每處Indels在樣本中的預(yù)期頻數(shù)和實(shí)際頻數(shù)計(jì)算p值，pO.Ol即判定為川亞型特異性的Indels。最終將川亞型特異性的Indels納入卜一步分析。

生物網(wǎng)絡(luò)學(xué)分析結(jié)果顯示，大多突變基因在網(wǎng)絡(luò)上相距較遠(yuǎn)（距離>2個節(jié)點(diǎn)），僅作為轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的027c與其他基因具有較為廣泛的聯(lián)系（圖1-5)。一方面，i?W027c可以調(diào)節(jié)下游it辦操縱子(RvI029-Rvl03I，鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)）的表達(dá)，另一方面又與蛋白i?v247介（功能未知的保守蛋白，氧化應(yīng)激條件下表達(dá)上調(diào)），Rv2712c (功能未知的保守蛋白，異煙肼或花生四烯酸處理后表達(dá)上調(diào)，提示其功能可能與自由脂肪酸應(yīng)激和分枝菌酸合成相關(guān)）以及/fv3327 (具有轉(zhuǎn)座酶活性，在亞x夯入贅孰暮蚐DS的剌激下表達(dá)上調(diào)，可能與DNA修復(fù)功能相關(guān)）存在蛋白質(zhì)之間相互作用。31
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R378.911

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2683992