【摘要】：FGFR3基因編碼區(qū)的功能增強型(Gain-of-function)點突變可引起多種人類骨骼遺傳病，包括人類非致死性侏儒最常見的類型--軟骨發(fā)育不全、致死性軟骨發(fā)育不全等。這些軟骨發(fā)育不良性疾病主要影響經(jīng)軟骨內(nèi)成骨過程形成的長骨。除部分患者除可通過外科手術(shù)進行部分延長肢體外，目前尚無有效的治療方法。 FGFR3是軟骨發(fā)育的負性調(diào)節(jié)分子，影響軟骨細胞的增殖活性和分化。Chen等發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)GFR3信號通過STAT1/p21抑制軟骨細胞增殖，通過Ihh抑制軟骨細胞分化。表達FGFR3ACH(FGFR3G380R)和TDII(FGFR3K650E)突變可導致ATDC5細胞凋亡增加，，而給予PTHrP處理后這種凋亡增加可緩解。PTH1-34抑制FGFR3突變所致的凋亡增加，增加突變所致的生長受抑。PTH1-34能否在體水平上緩解FGFR3功能增強所引起的軟骨發(fā)育不全及其可能的作用機制有待于研究。 FGFR3除影響骨骼發(fā)育外，還參與椎間盤穩(wěn)態(tài)維持。鑒于其在關(guān)節(jié)軟骨中促合成代謝，保護軟骨基質(zhì)免于降低的作用及終板、關(guān)節(jié)軟骨組成的相似性，我們提出FGFR3可能參與軟骨終板穩(wěn)態(tài)維持，并通過模式小鼠進行研究。 骨骼遺傳疾病致病基因的發(fā)現(xiàn)不僅有利于相關(guān)遺傳病與基因功能的研究，還極大地促進了對骨骼細胞發(fā)育分化調(diào)控機制的認識。短指是常見的骨骼發(fā)育不良性疾病，目前尚有較多導致短指的基因尚未克隆。我們通過細胞轉(zhuǎn)染結(jié)合報道基因活性檢測，初步鑒定了一種以E型短指、身材矮小為主要表型的骨骼發(fā)育不良性疾病的突變基因的功能。 研究方法： 第一部分： 1．給藥方式：出生當日的WT及ACH小鼠，分別隨機分為給藥組與對照組，給藥組給予100μg/(kg·d) PTH1-34皮下注射Fgfr3+/K644Eneo與EIIa-Cre交配，于懷孕E13.5天開始給予100μg/(kg·d) PTH1-34皮下注射至小鼠生產(chǎn)，對照組均給予等量注射用水直至觀察期結(jié)束； 2．統(tǒng)計小鼠存活情況，測定小鼠生長過程中體重、體長等的變化，采用X線攝影、μCT頭顱局部攝影，觀察小鼠大體形態(tài)及顱底軟骨連接的變化情況； 3．通過HE染色觀察次級骨化中心等生長板發(fā)育情況，μCT觀察小鼠成年期骨結(jié)構(gòu)； 4．采用PTH1-34間斷處理培養(yǎng)的WT及ACH小鼠胚胎骨組織，觀測其對培養(yǎng)骨組織生長的影響； 5． PTH處理培養(yǎng)的肢芽Micromass細胞，觀察其軟骨小結(jié)形成及基質(zhì)分泌； 6．利用前軟骨細胞及293T細胞轉(zhuǎn)染不同形式的FGFR3，研究PTH處理對相關(guān)分子表達及活性的影響。 第二部分： 1.建立軟骨中敲除FGFR3小鼠及成年期軟骨中敲除FGFR3的小鼠模型； 2.利用X線、μCT及組織切片阿爾新藍-蘇木素-伊紅染色觀察椎間盤； 3.免疫組化檢測小鼠椎間盤軟骨細胞基質(zhì)Col2、Col10，軟骨基質(zhì)酶類MMP13、ADMTS，成骨標志OC及血管標記VEGF、CD31表達； 4.定量檢測椎間盤組織中相關(guān)基因Col2、Col10、Aggrecan、OC、MMP13、ADMTS的表達變化。 第三部分： 1.通過前軟骨細胞ATDC5轉(zhuǎn)染不同形式的X，MTT及細胞計數(shù)檢測細胞增殖，阿爾新藍染色基質(zhì)分泌，定量檢測Col2、Col10、Aggrecan、PTHrP及FGFR3等軟骨分化相關(guān)基因表達； 2.構(gòu)建Pthlh不同長度報道基因，利用雙熒光素酶基因報告系統(tǒng)研究突變X對Pthlh轉(zhuǎn)錄活性的影響。 實驗結(jié)果： 一、PTH1-34可治療FGFR3功能增強的軟骨發(fā)育不良 1. PTH處理可使TDII小鼠存活，但存活的TDII小鼠仍然存在骨骼發(fā)育障礙：個體短小、骨骼短縮彎曲、生長板結(jié)構(gòu)紊亂、顱底軟骨連接提前閉合、骨小梁減少等； 2. PTH處理促進ACH小鼠大體生長，緩解其頭顱圓鈍，促進其次級骨化中心出現(xiàn)，以及改善其成年期骨量減少； 3. PTH可促進培養(yǎng)骨組織生長，并主要通過促進軟骨生長發(fā)揮作用； 4. PTH可促進ACH小鼠肢芽Micromass軟骨小結(jié)形成及基質(zhì)分泌； 5. PTH對ACH軟骨的影響可能通過降低FGFR3的表達及活性，促進PTHrP表達來完成。 二、FGFR3參與終板/椎間盤穩(wěn)態(tài)維持 1. ACH小鼠終板自發(fā)性退變----骨化較WT小鼠延遲； 2.全身及軟骨內(nèi)敲除FGFR3小鼠脊柱側(cè)彎、骨量減少、椎體生長板及終板結(jié)構(gòu)紊亂，椎體/椎間盤發(fā)退變較野生小鼠提前：骨贅生成； 3.成年期軟骨細胞敲除FGFR3后小鼠椎間盤終板出現(xiàn)退變的早期表現(xiàn)：軟骨基質(zhì)丟失，終板出現(xiàn)類似異位成骨的骨樣組織，成骨標記OC、軟骨基質(zhì)降解酶MMP13表達增加。 三、突變X基因抑制軟骨發(fā)育及Pthlh轉(zhuǎn)錄活性 1.突變X基因抑制軟骨增殖、基質(zhì)分泌及降低軟骨分化相關(guān)基因Col2、Col10、Aggrecan、PTHrP及FGFR3表達； 2.突變X可能通過pthlh基因啟動子上的AP1結(jié)合位點抑制其轉(zhuǎn)錄活性。 結(jié)論： 一、PTH1-34可治療FGFR3功能增強所致軟骨發(fā)育不全及致死性發(fā)育不良 二、FGFR3對終板/椎間盤退變有一定的保護作用 三、突變X基因可能通過抑制軟骨增殖分化、Pthlh轉(zhuǎn)錄活性及促進FGFR3表達導致軟骨發(fā)育障礙
【圖文】：

圖 2-1 FGFRG369C/+小鼠(ACH)基因型鑒定原理及電泳圖+/K644Eneo小鼠鑒定條帶大小約為 200bp(2 號泳道)，EIIap(1、2 號泳道)，重組小鼠鑒定條帶大小約 260、290bpR3-31 RINA+/K644Eneo(normal)1011約200bpR3-31 NR-36(TDII)1011約290bpLoxp*15neoK644E*15K644EEIIa-Cre1 2 1 2 1 2+/K644E

第三軍醫(yī)大學博士學位論文體的長度沒有明顯變化。表 2-3 2 月齡小鼠骨骼長度（n=4-6，單位：cm）Humerus Femur Vertebral（L1T control 1.29±0.07 1.48±0.03 1.47±0.04H-treated WT 1.30±0.02 1.50±0.04 1.47±0.04H control 1.01±0.03a1.21±0.03a1.38±0.04aH-treated ACH 1.14±0.02a,b1.34±0.05a,b1.44±0.03vsWT-,P <0.05; b :vsACH-, P<0.05
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R363

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1 金e

本文編號：2683213