【摘要】： 目的 多種原因，包括周圍血管損傷、主動(dòng)脈瘤手術(shù)、斷肢再植等疾病治療過程均可造成肢體缺血�；謴�(fù)充足的血供是缺血組織成活的關(guān)鍵，，然而缺血再灌注(ischemia-reperfusion，I／R)損傷卻可能導(dǎo)致遠(yuǎn)隔器官(如心、肺、肝、腎、小腸等)的損傷。目前，I／R后肢體及遠(yuǎn)隔臟器損傷的確切機(jī)制尚不清楚。近年研究發(fā)現(xiàn)，多型核粒細(xì)胞(polymorphonuclear neutrophil，PMN)的黏附、浸潤(rùn)及炎性介質(zhì)的釋放在骨骼肌I／R及其所致遠(yuǎn)隔臟器損傷過程中起關(guān)鍵作用。細(xì)胞黏附分子(ICAM)-1的表達(dá)則是介導(dǎo)PMN黏附、聚集并發(fā)揮作用的先決條件，而作為轉(zhuǎn)錄因子的核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)的激活是上述基因表達(dá)的前提。 為研究骨骼肌I／R后NF-κB及其相關(guān)基因在骨骼肌及遠(yuǎn)隔臟器中表達(dá)的變化規(guī)律，探討其機(jī)制及意義，同時(shí)通過局部灌注NF-κB decoy寡核苷酸及吡咯烷二硫代氨基甲酸鹽(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)抑制NF-κB及其相關(guān)基因的表達(dá)激活，檢測(cè)骨胳肌及遠(yuǎn)隔臟器損傷的改變，為防治I／R所致骨骼肌及遠(yuǎn)隔臟器功能的損害提供理論依據(jù)。 方法 1．動(dòng)物模型、分組及處理 雄性Wistar大鼠，體重250g±50g，隨機(jī)分為：假手術(shù)組(Sham，6只)，缺血組(ischemia，6只)，缺血再灌注組(I／R，42只)。2％戊巴比妥鈉40mg／kg行腹腔注射麻醉，分離股動(dòng)脈并用無創(chuàng)性血管夾夾閉4h。I／R組分別于再灌注1、2、4、8、12、24、48 h股靜脈采血，并取脛前肌、雙側(cè)腎及肺。另外還有PDTC組(100 mg／kg，12只)、NF-κB decoy組(200μg，12只)及雜碼(Scramble decoy)組(200μg，12只)，在再灌注前分別施加相應(yīng)的處理因素，再灌注8 h、24 h后取材。 2．組織學(xué)研究 標(biāo)本收集后，取部分骨骼肌、腎、肺葉，10％中性福爾馬林固定、石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅染色。計(jì)數(shù)肺泡間隔中的PMN數(shù)代表肺部扣 押的PMN。 3.肺組織濕/干重比率 取部分肺置入真空干燥器中烘烤24h，稱量組織重量。計(jì)算肺組織濕 /干重比率作為肺水腫的標(biāo)志。 4.MDA和MPO的檢測(cè) 參照丙二醛(MDA)或髓過氧化物酶(N田O)試劑盒說明檢測(cè)肺、腎組織 的MDA和MPO，分別作為脂質(zhì)過氧化和PMN浸潤(rùn)的指標(biāo)。 5.半定量Rl’- PCR 采用Trizol提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條 件:94oC變性2 min，94 oC 3 05，5 5 oC 305，72oC 455，共30個(gè)循環(huán)，72oC 延伸5 min。2%瓊脂糖電泳，凝膠成像系統(tǒng)上攝像并分析吸光度值。 基因表達(dá)值=NF一忍p65(ICAM一1，I一沼p)/p一actin 6.原位雜交 標(biāo)本固定、脫水，ocT包埋后冰凍切片。按照NF一慮p65 mRNA或 ICAM一1 mRNA檢測(cè)試劑盒說明進(jìn)行染色。光鏡觀察:400x鏡下，計(jì)數(shù)單 位視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)百分比。 7.M觸stem blot蛋白印跡 剪碎組織后置于裂解液中機(jī)械勻漿并提取總蛋白，測(cè)總蛋白質(zhì)濃度。 10%SDS一聚丙烯酞胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜。5%脫脂奶粉封閉，一抗NF一忍p65、 I一出p、IeAM一l、TNFa或aet認(rèn)(1:一000)，4oC過夜，洗膜，加入過氧化物 酶標(biāo)記的馬抗山羊IgG.HRp，洗膜后加ECL，暗室顯影后沖洗膠片。凝膠 成像分析系統(tǒng)上攝像分析，計(jì)算出吸光度值。 8.免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水;按試劑盒說明染色。光鏡觀察:400x高倍 鏡下，計(jì)數(shù)單位視野內(nèi)陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)百分比。 9.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 結(jié)果用*士s表示，采用SSPS10.0軟件分析各組數(shù)據(jù)，組間比較采用t 檢驗(yàn)。 結(jié)果 組織形態(tài)學(xué)改變 缺血組的骨骼肌纖維間隙增寬，部分肌纖維水腫、變性;再灌注1一 8h，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，在組織中有較多白細(xì)胞浸潤(rùn)，肌纖維水腫;再灌 注8~12h，肌纖維變形、變粗，結(jié)構(gòu)模糊，肌溶嚴(yán)重，可見大量白細(xì)胞浸 潤(rùn);再灌注24~48h，肌纖維水腫、變性有所改善，逐漸恢復(fù)正常;假手 術(shù)組無明顯變化。 再灌注4h，腎臟即出現(xiàn)組織學(xué)改變，表現(xiàn)為腎小管上皮細(xì)胞水腫，8一 12h表現(xiàn)最為明顯，48h基本恢復(fù)正常。再灌注4h，I瓜組肺組織病理切片 提示有明顯的彌散功能障礙，表現(xiàn)為間質(zhì)浸潤(rùn)細(xì)胞增多并伴有水腫，肺毛 細(xì)血管床內(nèi)可見大量的PMN聚集、附壁。肺泡中有淡紅色滲出液及PMN 滲出，局部肺不張，再灌注12h尤其明顯。假手術(shù)組和缺血組的肺或腎小 管和腎小球結(jié)構(gòu)無明顯改變。 再灌注sh，NF一出decoy組和PDTc組的骨胳肌、肺及腎小管上皮細(xì) 胞水腫明顯緩解，間質(zhì)浸潤(rùn)的炎性細(xì)胞亦減少;24h骨胳肌、肺及腎組織 學(xué)改變基本恢復(fù)正常。 2.血漿BUN、Cr及肺PMN、組織率(w/T)的改變 I瓜組各時(shí)點(diǎn)，血漿中BUN、Cr較假手術(shù)組和缺血組明顯增加，差異 有非常顯著意義(P0.01)。I瓜組肺組織濕/干重增高，再灌注24h最為明 顯，與假手術(shù)組和缺血組比較差異均有顯著意義(P0.01)。肺泡間隔中的 PMN計(jì)數(shù)在I瓜組均顯著增加。NF一沼decoy和PDTC處理能夠改善腎功 能，減輕肺PMN扣押和濕/干重比。 3.MDA、MPO的檢測(cè) 1爪組腎或肺組織MDA和MPO活性顯著增高，與缺血組比較差異有 顯著意義(P0.01)。早在再灌注4h即明顯增高，12
【圖文】：

RT-PcR表明I瓜組各時(shí)點(diǎn)哪一出p65mRNA、IcAM一1mRNA表達(dá)較假手術(shù)組、缺血組增加，在灌注后8一12h達(dá)高峰;I一出pmRNA表達(dá)在1/R后同樣開始增加，24h的表達(dá)量最多(圖11一13)。

~ICAM~p一actin圖11骨骼肌中ICAM一1mRNA的Rl’-PCR電泳圖M:Marker:l:假手術(shù)組，2.缺血組，3~9分別為I爪組再灌注后lh、和48h。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R363

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 楊國(guó)華,李志海,楊春珠,孟慶剛;鈣拮抗劑對(duì)大鼠腹部皮瓣抗氧化作用的研究[J];中華手外科雜志;2000年01期

2 胡新華,張強(qiáng),辛世杰,張真發(fā),段佩琰;抑制核轉(zhuǎn)錄因子-κB對(duì)移植靜脈內(nèi)膜增生的影響[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;2003年07期

3 胡新華,楊軍,張強(qiáng),張真發(fā),張?zhí)?段佩琰,段志泉;核轉(zhuǎn)錄因子κB decoy寡核苷酸對(duì)移植靜脈內(nèi)膜增生的影響[J];中華外科雜志;2003年09期

本文編號(hào)：2682937