發(fā)布時(shí)間：2020-05-25 12:09

【摘要】：精子形成過(guò)程一般分為三個(gè)不同的階段，1)精原細(xì)胞通過(guò)有絲分裂快速擴(kuò)增；2)精母細(xì)胞通過(guò)減數(shù)分裂形成精細(xì)胞，在這一過(guò)程中伴有同源染色體的配對(duì)和交換；3)精細(xì)胞變形成為精子。在這三個(gè)過(guò)程中，有許多睪丸特異和非特異基因次第表達(dá)，并在生精過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。 四川大學(xué)華西醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳室近年來(lái)致力于男性不育相關(guān)基因的克隆及功能研究工作，并取得了一些進(jìn)展。通過(guò)消減雜交，mRNA差異顯示等技術(shù)，克隆了多個(gè)可能與男性生育相關(guān)的新基因，如ZNF230、ZNF463、ZNF313及TCP11等。這些基因基本上在睪丸組織中均有高表達(dá)或特異表達(dá)。目前該實(shí)驗(yàn)室正運(yùn)用酵母雙雜交、基因敲除、RNAi等多種方法研究這些基因的功能。 為了在蛋白質(zhì)水平研究這些基因在睪丸組織的表達(dá)情況，我們將TCP11基因和ZNF313基因克隆到大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，并利用表達(dá)的蛋白制備抗體，進(jìn)行組織化學(xué)分析，以期了解這些基因在睪丸組織中的表達(dá)狀態(tài)，對(duì)其功能進(jìn)行進(jìn)行推測(cè)。 第一部分：人受精促進(jìn)肽受體TCP11a基因的蛋白表達(dá)及細(xì)胞組織分布 人TCP11基因編碼人受精促進(jìn)肽受體，該基因存在多個(gè)剪切體。我們選擇剪切體TCP11a基因進(jìn)行表達(dá)，制備抗體以研究TCP11蛋白在睪丸及精細(xì)胞上的分布。 通過(guò)PCR等分子克隆技術(shù)，我們將TCPlla基因克隆到pBv220表達(dá)載 體上，通過(guò)DNA測(cè)序及表達(dá)產(chǎn)物的N一端測(cè)定證實(shí)了克隆基因表達(dá)產(chǎn)物的正確 性。然后我們還對(duì)工程菌TCPlla蛋白的表達(dá)條件進(jìn)行了研究，使TCPlla蛋 白在工程菌中高效表達(dá)。并利用表達(dá)蛋白制備的抗體進(jìn)行了組織化學(xué)分析。 結(jié)果顯示:TCPll蛋白在鼠皋丸組織中分布具有細(xì)胞特異性，即它僅見(jiàn)于長(zhǎng) 形精子細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中和細(xì)胞膜上，而在精原細(xì)胞、精母細(xì)胞、支持細(xì)胞、 間質(zhì)細(xì)胞和精子的細(xì)胞核中均未觀察到。這提示TCPll基因可能在精子的最 后成熟時(shí)期才發(fā)揮作用，并對(duì)精子形態(tài)及其生理功能有重要作用。對(duì)可育男 性成熟精子的熒光標(biāo)記結(jié)果顯示，TCPn蛋白主要分布于精子的頂體和尾部， 該結(jié)果與鼠TCPn蛋白在其精子表面分布結(jié)果基本一致。 在上述工作基礎(chǔ)上，運(yùn)用生物信息分析方法，對(duì)TCPll基因及TCPlla 蛋白進(jìn)行了深入分析。將人TCPll基因與小鼠、大鼠、雞及猩猩的同源基因 進(jìn)行了同源性分析，包括比較各外顯子和內(nèi)含子的保守性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在TCPn 基因上游約3Okb的范圍內(nèi)有許多保守的非編碼序列，它們很可能是調(diào)控 TCPn基因特異性表達(dá)的增強(qiáng)子或其他調(diào)控元件。對(duì)其中最保守的一個(gè)非編 碼序列進(jìn)行共有調(diào)控因子結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該序列內(nèi)存在較多的重 要調(diào)控因子的結(jié)合位點(diǎn)。對(duì)人TCPll基因的CPG島分析發(fā)現(xiàn)在人TCPH啟動(dòng) 子區(qū)周?chē)嬖诘囊粋�(gè)CpG島，同樣存在于大鼠、小鼠。啟動(dòng)子區(qū)CpG島的甲 基化和去甲基化可能參與了TCPn的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。對(duì)TCPlla蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu) 預(yù)測(cè)的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該蛋白結(jié)構(gòu)十分特殊，二級(jí)結(jié)構(gòu)中僅有Q一螺旋結(jié)構(gòu)。它 有較多的潛在的翻譯后修飾位點(diǎn)，特別是不同類(lèi)型的磷酸化位點(diǎn)。對(duì)TCPll 基因和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析有助于了解它們的功能。 第二部分:人精子發(fā)生相關(guān)基因--一多W召了3在大腸桿菌中的克隆表達(dá)及組 織分布 鋅指蛋白是一類(lèi)廣泛存在于動(dòng)植物及人類(lèi)的DNA結(jié)合蛋白。由于能選 擇性地結(jié)合各種DNA和RNA序列，它們?cè)诨虻谋磉_(dá)調(diào)控中起著十分重要的 作用。CZHZ和C3HC4鋅指是較為常見(jiàn)的兩種鋅指結(jié)構(gòu)域，但很少同時(shí)存在于 同一個(gè)鋅指蛋白。而我們克隆表達(dá)的ZNF313蛋白卻同時(shí)含有這兩種結(jié)構(gòu)域。 利用PCR方法，將人ZNF313基因克隆到pET一32(a)載體上，使之以融 合蛋白形式表達(dá)。在DNA序列測(cè)定、蛋白N一端序列測(cè)定證實(shí)了克隆表達(dá)的正 確性后，我們對(duì)工程菌發(fā)酵條件、蛋白純化條件進(jìn)行了研究，并利用純化的 ZNF3 13蛋白制備抗體供人辜丸組織切片組織化學(xué)分析。免疫組化分析顯示在 精原細(xì)胞、圓形精子細(xì)胞、精母細(xì)胞的細(xì)胞核中出現(xiàn)，而Sertoli細(xì)胞、精 子細(xì)胞中未.呈陽(yáng)性反應(yīng)。這表明ZNF313基因在翠丸特定細(xì)胞類(lèi)型的特定階 段中進(jìn)行表達(dá)，并提示它在生精過(guò)程中可能發(fā)揮重要作用。 對(duì)ZNF313蛋白和基因的生物信息學(xué)分析獲得了如下的結(jié)果:1)ZNF313 鋅指結(jié)構(gòu)域的3D結(jié)構(gòu)模擬發(fā)現(xiàn)ZNF3 13的Ring鋅指和第二個(gè)CZHZ鋅指均可 以形成正常的鋅指結(jié)構(gòu);2)通過(guò)EST序列拼接電子克隆法獲得了稱(chēng)猴、大 鼠、非洲蛙、非洲爪蟾、青鱷、虹蹲及豬的ZNF313直系同源基因，通過(guò)基 因組比對(duì)，，獲得了雞的ZNF313同源基因。蛋白質(zhì)水平的比對(duì)發(fā)現(xiàn):不同種 生物ZNF313的RING和三個(gè)CZHZ鋅指結(jié)構(gòu)其周?chē)陌被嵝蛄芯直Ｊ兀?提示幾個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域?qū)τ赯NF3 13的生物學(xué)功能可能具有十分重要的作用。3) 對(duì)人和黑猩猩ZNF313基因上游調(diào)控因子的結(jié)合位點(diǎn)分析表明:轉(zhuǎn)錄起始位 點(diǎn)上游30一13Obp處有一個(gè)十分保守的區(qū)域，后者包涵有有許多重要轉(zhuǎn)錄調(diào) 控因子的潛在結(jié)合位點(diǎn)。它們可能是與調(diào)控因子相互作用的靶點(diǎn)。然而人 ZNF313與小鼠Znf313的上游調(diào)控因子結(jié)合位點(diǎn)比較則發(fā)現(xiàn)它們的同源保守 性較低，這是否意味著人與小鼠ZNF3 13的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控模式不同，尚待研 究。4)旁系同源基因分析結(jié)構(gòu)表明，在人16q24.3區(qū)域存在的一個(gè)基因， 其蛋白結(jié)構(gòu)與ZNF313非常相近
【圖文】：

6、PurifiedreeombinantTCPllaProteinFigg:ExPressionandPurifieationofTCPllaProteininE.ColiDH5a圖9:TCPlla蛋白在E.ColiDHS。表達(dá)及純化各步電泳結(jié)果22

Fig.12TheseeondstrueturePredieationofTCPlla圖12.TCPlla蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)2.5‘2TCPlla蛋白的修飾位點(diǎn)的預(yù)測(cè)分析分析結(jié)果表明TCPll蛋白具有較多的潛在的蛋白修飾位點(diǎn)，如N一糖基化位點(diǎn)，豆范酞化位點(diǎn)，和磷酸化位點(diǎn)等等。值得注意的是，這個(gè)蛋白磷酸25
【學(xué)位授予單位】：四川大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類(lèi)號(hào)】：Q786

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 尹積榮;楊凱;白玉興;王邦康;;甲狀旁腺素的生物信息學(xué)分析[J];口腔醫(yī)學(xué)研究;2011年07期

2 齊麟;向志明;張彤;;斑馬魚(yú)SAA基因克隆及表達(dá)分析[J];河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2011年05期

3 王景龍;王興龍;;羊布魯氏菌甲�；D(zhuǎn)移酶的生物信息學(xué)研究[J];中國(guó)畜牧獸醫(yī);2011年07期

4 陸佳;肖良;王倩倩;蔡濱欣;張黎明;;海葵溶細(xì)胞素的生物信息學(xué)分析[J];中國(guó)生化藥物雜志;2011年04期

5 任磊;王雁;周琳;彭鎮(zhèn)華;;牡丹PsCS基因的克隆及序列分析[J];生物技術(shù)通報(bào);2011年09期

6 杜翠紅;蘇文金;盧寶駒;劉光明;邱曉燕;曹敏杰;;鱖魚(yú)(Siniperca chuatsi)幽門(mén)垂中兩種胰蛋白酶的cDNA克隆及其生物信息學(xué)分析[J];海洋與湖沼;2011年02期

7 田磊;張大文;黃小平;;重金屬在珠江口海域兩種腹足類(lèi)動(dòng)物組織中的分布與累積[J];生態(tài)學(xué)雜志;2011年07期

8 劉亞玲;王俊杰;云錦鳳;趙彥;侯永霞;;黃花苜蓿LEA3基因片段克隆與生物信息學(xué)分析[J];生物技術(shù)通報(bào);2011年07期

9 張凌紅;段雅樂(lè);李于博;萬(wàn)學(xué)梅;趙政;;羅格列酮在大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)及組織分布研究(英文)[J];華東師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2011年04期

10 黃愛(ài)優(yōu);王廣策;何林文;牛建峰;張寶玉;;滸苔小RNA高通量測(cè)序及相關(guān)生物信息學(xué)分析[J];科學(xué)通報(bào);2011年24期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 魯蘭;黃源芳;賈乾斌;鄧勇;劉小康;;新肝靶向抗腫瘤化合物EVk的組織分布的初步研究[A];第十屆全國(guó)化療藥理暨抗感染藥理高峰論壇資料匯編[C];2010年

2 麻巧迎;張帥;王春義;雒s

本文編號(hào)：2680133