【摘要】： 漢坦病毒(Hantavirus)是引起人腎綜合征出血熱(Hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)和人漢坦病毒性肺炎綜合征(Hantavirus pulmonary syndrome，HPS)的病原體，在世界各大洲均有流行。漢坦病毒感染及其引起的相關(guān)疾病已成為嚴(yán)重的世界性公共衛(wèi)生問題之一。 漢坦病毒基因組為分三節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA，即大(L)、中(M)、小(S)三個(gè)基因片段，依次編碼病毒的RNA聚合酶L蛋白，外膜蛋白G1、G2以及核蛋白(NP)。由S基因編碼的核蛋白是漢坦病毒重要的結(jié)構(gòu)蛋白成份，對(duì)調(diào)節(jié)病毒的復(fù)制，刺激宿主保護(hù)性細(xì)胞免疫反應(yīng)以及調(diào)控細(xì)胞凋亡信號(hào)路徑等方面有重要的作用。 漢坦病毒Z10和Z37株是兩個(gè)分離自不同宿主及不同血清型的重要中國(guó)疫苗株，其中Z10株分離自出血熱病人血清，血清學(xué)分型為漢灘型病毒(Hantaan，HTNV)；Z37株分離自家鼠，其血清學(xué)分型為漢城型病毒(Seoul，SEOV)。具有血凝滴度高和誘導(dǎo)中和性抗體能力強(qiáng)的特點(diǎn)。本論文主要研究了漢坦病毒疫苗株Z10和Z37核蛋白體內(nèi)、體外表達(dá)，核蛋白與基因組末端反向重復(fù)序列相互作用以及核蛋白對(duì)鼠源性巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。 核蛋白相對(duì)保守，常作為漢坦病毒分子進(jìn)化親緣性分析的依據(jù)。為了解漢坦病毒疫苗株Z10與Z37基因分型及與其他毒株在進(jìn)化上的親緣性，克隆并序列測(cè)定了Z10和Z37核蛋白全基因，二者核蛋白在核苷酸水平和氨基酸水平的同源性分別為75.1％和80.6％；進(jìn)化樹分析表明Z10株與HTNV代表株76／118以 腳紅久~弓理多弓護(hù)脫耀_戶學(xué)企訟戈 茄蘿 及中國(guó)H丁NV分離株Ag有一定的遺傳差異，在進(jìn)化上偏向于HTNV型，但卻是 介于HTNV型與SEOV型之間的毒株:而237株不僅與SEOV型中國(guó)分離株R22， 甚至與SEOV型英國(guó)分離株皿461都有很大的親緣性。該結(jié)果說明不同地域來(lái)源 的SEOV型毒株之間有較大的保守性，而HTNV型毒株因地理區(qū)域的不同變異 性較大。 核蛋白能不僅能刺激宿主保護(hù)性細(xì)胞免疫，而且可聚合形成的病毒樣顆粒 (vLP)，在作為亞單位膚類疫苗目標(biāo)蛋白以及分型診斷抗原具有很大的應(yīng)用潛 力。為了獲得純化的可溶性重組核蛋白，構(gòu)建了210和237株核蛋白原核表達(dá) 載體并在大腸桿菌中表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)在較低的溫度(18“C)和較低濃度IPTG(100 mM)條件下誘導(dǎo)表達(dá)過夜可提高可溶性核蛋白的產(chǎn)量。然后以液相色譜分別經(jīng) Ni一NAT親和柱和HIPreP 16廠10 DEAE離子交換柱二步純化獲得高純度的重組 核蛋白，產(chǎn)量約為0.2 mg每升菌液。并對(duì)純化的210和237株核蛋白分別以胰 蛋白酶不完全消化后用\\飛stem blot進(jìn)行區(qū)分和鑒定。本研究建立的表達(dá)純化條 件對(duì)大規(guī)模生產(chǎn)純化的核蛋白具有很好的參考價(jià)值。 核蛋白在細(xì)胞內(nèi)不同區(qū)域的分布，表達(dá)以及存在方式不僅對(duì)病毒本身的復(fù)制 水平而且對(duì)被感染的宿主細(xì)胞基因調(diào)控有重要的影響，為了解內(nèi)源性核蛋白的表 達(dá)及細(xì)胞內(nèi)的分布情況，構(gòu)建了漢坦病毒210株核蛋白基因與鼠干細(xì)胞反轉(zhuǎn)錄病 毒(入ISCv)重組載體，通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入產(chǎn)病毒的包裝細(xì)胞系BOSC23中 產(chǎn)生完整的重組MscV一FlagNP病毒。然后以重組病毒直接感染NIH 3T3細(xì)胞， 利用P盯。mycin對(duì)感染細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)壓力篩選，獲得了轉(zhuǎn)核蛋白抗性細(xì)胞。分別 用Southem blot和PCR方法可檢測(cè)到核蛋白基因在抗性細(xì)胞染色體中完整地整 合，并且用westem blot在抗性細(xì)胞中可檢測(cè)到核蛋白穩(wěn)定的表達(dá)。進(jìn)一步以Flag 單克隆抗體介導(dǎo)的免疫熒光染色聯(lián)合共聚焦激光掃描熒光顯微鏡分析了內(nèi)源性 Flag融合核蛋白在抗性細(xì)胞內(nèi)分布，發(fā)現(xiàn)核蛋白主要分布于胞漿及胞核周圍區(qū)， 并且部分核蛋白可聚集形成胞漿包涵體。核蛋白主要分布于胞漿及胞核周圍區(qū)， 并且部分核蛋白可聚集形成胞漿包涵體。 漢坦病毒基因組的一個(gè)重要特點(diǎn)是每個(gè)基因片段兩個(gè)末端都具有一段長(zhǎng)為 18個(gè)核普酸的高度保守的反向重復(fù)序列，互補(bǔ)可形成雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)。為了研究 葫乏乙久弓勢(shì)治鰲二筍炭，厚士學(xué)夕落忿戈 藺要 該雙鏈結(jié)構(gòu)在核蛋白包裝病毒基因組RNA中的作用與功能，以T4 DNA激酶同 位素標(biāo)記一對(duì)人工合成互補(bǔ)的18個(gè)核營(yíng)酸反向重復(fù)序列，制備雙鏈探針，以模 擬基因片段末端反向重復(fù)序列形成的雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)。然后以電泳移動(dòng)阻滯實(shí)驗(yàn) (E MSA)分析了210和237株純化重組核蛋白在非變性膠中與反向重復(fù)序列雙 鏈探針相互作用的可能性，發(fā)現(xiàn)重組210和237核蛋白在體外非變性膠中均能 特異結(jié)合基因組末端反向重復(fù)序列形成的雙鏈探針，該結(jié)果提示基因片段末端反 向重復(fù)序列形成的雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)可能是保證核蛋白正確包裝病毒基因組重要信 號(hào)序列和作用位點(diǎn)。 在漢坦病毒感染過程中，巨噬細(xì)胞是除上皮細(xì)胞外最早被感染的細(xì)胞。為了 解核蛋白在漢坦病毒感染巨噬細(xì)胞時(shí)的作用， 刺激或細(xì)胞內(nèi)大量表達(dá)對(duì)鼠源性巨噬細(xì)胞系 分析了210和237核蛋白細(xì)胞外 J774的影響。 和237大腸桿菌表達(dá)的重組的核蛋白與鼠源性巨噬細(xì)胞系 發(fā)現(xiàn)以Zmg/l的210 J774共培養(yǎng)可引起明 顯的生長(zhǎng)抑制以及細(xì)胞出現(xiàn)脫落，破碎等病理變化;而在轉(zhuǎn)染有210核蛋白真核 瞬時(shí)表達(dá)載體的巨噬細(xì)胞中雖然用Westem blot能檢測(cè)到核蛋白大量表達(dá)，但并 ?
【圖文】：

T7和SP6進(jìn)行雙向測(cè)序，獲得基因的全序列。210和237核蛋白編碼基因均由1290個(gè)核普酸組成(包括起始密碼ATG及終止碼TGA)，共編碼429個(gè)氨基酸。210和237核蛋白基因及推導(dǎo)的氨基酸序列(見圖1一3A和B)。3.0kb1.6kb1.0kb圖1一2210，237核蛋白克隆載體雙酶切鑒定圖Figurel一2IdentifieationofreeombinantPlasmidswithdoublerestrietionenzymedigestionM:DNAmarkers;1:PGEM一T一2105/Hind111，KPnl;2:PGEM一T一2375/EcoRI沐鄉(xiāng)nl

理_關(guān)一嘗夕淪義M2105M2375圖1一1RT一PCR擴(kuò)增210和237核蛋白cnNA結(jié)果Figurel一1Rl，一pCRamPlificationofcDNAscodingfulllengthnucleocaPsidProteinsofHantavirus210and237strains1:210NPeDNA;2:237NPeDNA;M:入DNAjEcoRI+Hl’ndIII1.3.3.序列測(cè)定將構(gòu)建好的克隆載體pGEM一T一2105與pGEM一T一2375由上海植物生理所以引物T7和SP6進(jìn)行雙向測(cè)序，，獲得基因的全序列。210和237核蛋白編碼基因均由1290個(gè)核普酸組成(包括起始密碼ATG及終止碼TGA)，共編碼429個(gè)氨基酸。210和237核蛋白基因及推導(dǎo)的氨基酸序列(見圖1一3A和B)。3.0kb1.6kb1.0kb圖1一2210，237核蛋白克隆載體雙酶切鑒定圖Figurel一2IdentifieationofreeombinantPlasmidswithdoublerestrietionenzymedigestionM:DNAmarkers;1:PGEM一T一2105/Hind111，KPnl;2:PGEM一T一2375/EcoRI沐鄉(xiāng)nl
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R346

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 劉合賓,劉克洲,翁景清,朱智勇;漢坦病毒疫苗株Z10與Z37重組核蛋白NP的表達(dá)純化及其特異結(jié)合基因組末端反向重復(fù)序列的功能研究[J];病毒學(xué)報(bào);2004年02期

本文編號(hào)：2680761