【摘要】： 漢坦病毒(Hantavirus)是引起人腎綜合征出血熱(Hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)和人漢坦病毒性肺炎綜合征(Hantavirus pulmonary syndrome，HPS)的病原體，在世界各大洲均有流行。漢坦病毒感染及其引起的相關疾病已成為嚴重的世界性公共衛(wèi)生問題之一。 漢坦病毒基因組為分三節(jié)段的單股負鏈RNA，即大(L)、中(M)、小(S)三個基因片段，依次編碼病毒的RNA聚合酶L蛋白，外膜蛋白G1、G2以及核蛋白(NP)。由S基因編碼的核蛋白是漢坦病毒重要的結構蛋白成份，對調節(jié)病毒的復制，刺激宿主保護性細胞免疫反應以及調控細胞凋亡信號路徑等方面有重要的作用。 漢坦病毒Z10和Z37株是兩個分離自不同宿主及不同血清型的重要中國疫苗株，其中Z10株分離自出血熱病人血清，血清學分型為漢灘型病毒(Hantaan，HTNV)；Z37株分離自家鼠，其血清學分型為漢城型病毒(Seoul，SEOV)。具有血凝滴度高和誘導中和性抗體能力強的特點。本論文主要研究了漢坦病毒疫苗株Z10和Z37核蛋白體內、體外表達，核蛋白與基因組末端反向重復序列相互作用以及核蛋白對鼠源性巨噬細胞生長的影響。 核蛋白相對保守，常作為漢坦病毒分子進化親緣性分析的依據。為了解漢坦病毒疫苗株Z10與Z37基因分型及與其他毒株在進化上的親緣性，克隆并序列測定了Z10和Z37核蛋白全基因，二者核蛋白在核苷酸水平和氨基酸水平的同源性分別為75.1％和80.6％；進化樹分析表明Z10株與HTNV代表株76／118以 腳紅久~弓理多弓護脫耀_戶學企訟戈 茄蘿 及中國H丁NV分離株Ag有一定的遺傳差異，在進化上偏向于HTNV型，但卻是 介于HTNV型與SEOV型之間的毒株:而237株不僅與SEOV型中國分離株R22， 甚至與SEOV型英國分離株皿461都有很大的親緣性。該結果說明不同地域來源 的SEOV型毒株之間有較大的保守性，而HTNV型毒株因地理區(qū)域的不同變異 性較大。 核蛋白能不僅能刺激宿主保護性細胞免疫，而且可聚合形成的病毒樣顆粒 (vLP)，在作為亞單位膚類疫苗目標蛋白以及分型診斷抗原具有很大的應用潛 力。為了獲得純化的可溶性重組核蛋白，構建了210和237株核蛋白原核表達 載體并在大腸桿菌中表達，我們發(fā)現在較低的溫度(18“C)和較低濃度IPTG(100 mM)條件下誘導表達過夜可提高可溶性核蛋白的產量。然后以液相色譜分別經 Ni一NAT親和柱和HIPreP 16廠10 DEAE離子交換柱二步純化獲得高純度的重組 核蛋白，產量約為0.2 mg每升菌液。并對純化的210和237株核蛋白分別以胰 蛋白酶不完全消化后用\\飛stem blot進行區(qū)分和鑒定。本研究建立的表達純化條 件對大規(guī)模生產純化的核蛋白具有很好的參考價值。 核蛋白在細胞內不同區(qū)域的分布，表達以及存在方式不僅對病毒本身的復制 水平而且對被感染的宿主細胞基因調控有重要的影響，為了解內源性核蛋白的表 達及細胞內的分布情況，構建了漢坦病毒210株核蛋白基因與鼠干細胞反轉錄病 毒(入ISCv)重組載體，通過磷酸鈣轉染法導入產病毒的包裝細胞系BOSC23中 產生完整的重組MscV一FlagNP病毒。然后以重組病毒直接感染NIH 3T3細胞， 利用P盯。mycin對感染細胞進行連續(xù)壓力篩選，獲得了轉核蛋白抗性細胞。分別 用Southem blot和PCR方法可檢測到核蛋白基因在抗性細胞染色體中完整地整 合，并且用westem blot在抗性細胞中可檢測到核蛋白穩(wěn)定的表達。進一步以Flag 單克隆抗體介導的免疫熒光染色聯(lián)合共聚焦激光掃描熒光顯微鏡分析了內源性 Flag融合核蛋白在抗性細胞內分布，發(fā)現核蛋白主要分布于胞漿及胞核周圍區(qū)， 并且部分核蛋白可聚集形成胞漿包涵體。核蛋白主要分布于胞漿及胞核周圍區(qū)， 并且部分核蛋白可聚集形成胞漿包涵體。 漢坦病毒基因組的一個重要特點是每個基因片段兩個末端都具有一段長為 18個核普酸的高度保守的反向重復序列，互補可形成雙鏈發(fā)夾結構。為了研究 葫乏乙久弓勢治鰲二筍炭，厚士學夕落忿戈 藺要 該雙鏈結構在核蛋白包裝病毒基因組RNA中的作用與功能，以T4 DNA激酶同 位素標記一對人工合成互補的18個核營酸反向重復序列，制備雙鏈探針，以模 擬基因片段末端反向重復序列形成的雙鏈發(fā)夾結構。然后以電泳移動阻滯實驗 (E MSA)分析了210和237株純化重組核蛋白在非變性膠中與反向重復序列雙 鏈探針相互作用的可能性，發(fā)現重組210和237核蛋白在體外非變性膠中均能 特異結合基因組末端反向重復序列形成的雙鏈探針，該結果提示基因片段末端反 向重復序列形成的雙鏈發(fā)夾結構可能是保證核蛋白正確包裝病毒基因組重要信 號序列和作用位點。 在漢坦病毒感染過程中，巨噬細胞是除上皮細胞外最早被感染的細胞。為了 解核蛋白在漢坦病毒感染巨噬細胞時的作用， 刺激或細胞內大量表達對鼠源性巨噬細胞系 分析了210和237核蛋白細胞外 J774的影響。 和237大腸桿菌表達的重組的核蛋白與鼠源性巨噬細胞系 發(fā)現以Zmg/l的210 J774共培養(yǎng)可引起明 顯的生長抑制以及細胞出現脫落，破碎等病理變化;而在轉染有210核蛋白真核 瞬時表達載體的巨噬細胞中雖然用Westem blot能檢測到核蛋白大量表達，但并 ?
【圖文】：

T7和SP6進行雙向測序，獲得基因的全序列。210和237核蛋白編碼基因均由1290個核普酸組成(包括起始密碼ATG及終止碼TGA)，共編碼429個氨基酸。210和237核蛋白基因及推導的氨基酸序列(見圖1一3A和B)。3.0kb1.6kb1.0kb圖1一2210，237核蛋白克隆載體雙酶切鑒定圖Figurel一2IdentifieationofreeombinantPlasmidswithdoublerestrietionenzymedigestionM:DNAmarkers;1:PGEM一T一2105/Hind111，KPnl;2:PGEM一T一2375/EcoRI沐鄉(xiāng)nl

理_關一嘗夕淪義M2105M2375圖1一1RT一PCR擴增210和237核蛋白cnNA結果Figurel一1Rl，一pCRamPlificationofcDNAscodingfulllengthnucleocaPsidProteinsofHantavirus210and237strains1:210NPeDNA;2:237NPeDNA;M:入DNAjEcoRI+Hl’ndIII1.3.3.序列測定將構建好的克隆載體pGEM一T一2105與pGEM一T一2375由上海植物生理所以引物T7和SP6進行雙向測序，，獲得基因的全序列。210和237核蛋白編碼基因均由1290個核普酸組成(包括起始密碼ATG及終止碼TGA)，共編碼429個氨基酸。210和237核蛋白基因及推導的氨基酸序列(見圖1一3A和B)。3.0kb1.6kb1.0kb圖1一2210，237核蛋白克隆載體雙酶切鑒定圖Figurel一2IdentifieationofreeombinantPlasmidswithdoublerestrietionenzymedigestionM:DNAmarkers;1:PGEM一T一2105/Hind111，KPnl;2:PGEM一T一2375/EcoRI沐鄉(xiāng)nl
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R346

【參考文獻】

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1 劉合賓,劉克洲,翁景清,朱智勇;漢坦病毒疫苗株Z10與Z37重組核蛋白NP的表達純化及其特異結合基因組末端反向重復序列的功能研究[J];病毒學報;2004年02期

本文編號：2680761