【摘要】：抗原特異性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(cyotoxic T lymphocytes, CTL)通過(guò)識(shí)別細(xì)胞表面與主要組織相容性抗原(major histocompatibility complex, MHC)-Ⅰ類(lèi)分子結(jié)合的抗原肽而殺傷靶細(xì)胞，是機(jī)體抗腫瘤、抗移植物及有效控制各種感染的重要免疫防御反應(yīng)之一。定量分析CTL可為闡明免疫應(yīng)答的自然發(fā)生過(guò)程提供重要信息。傳統(tǒng)的定量CTL的方法如~(51)Cr釋放實(shí)驗(yàn)、有限稀釋法(limited dilution assays, LDA)等需要體外淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，敏感性低。新近開(kāi)發(fā)的由人類(lèi)白細(xì)胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)重鏈和β-2微球蛋白(β-2microglobulin, β-2m)輕鏈、抗原肽和染料標(biāo)記的連接蛋白組成的四聚體試劑，具有高敏感性、特異性和高效性等特點(diǎn)，不僅能夠直接計(jì)數(shù)抗原特異性T細(xì)胞，還能對(duì)其進(jìn)行表型和功能方面的分析，大大推進(jìn)了我們認(rèn)識(shí)抗原特異性CTLs在疾病中作用的研究。 在四聚體的合成中，首先用基因工程法合成MHC重鏈和β-2微球蛋白輕鏈。但迄今為止，國(guó)外合成的這兩種蛋白均采用化學(xué)誘導(dǎo)劑IPTG(isopropyl β-D-thiogalactopyranoside)來(lái)誘導(dǎo)。IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)不僅價(jià)格昂貴、操作繁瑣，而且對(duì)細(xì)胞有較強(qiáng)的毒性，不適合大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)。本研究利用RT-PCR技術(shù)從人外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMC)中擴(kuò)增出HLA-A0201細(xì)胞膜外部分和去除信號(hào)肽部分的β-2m基因；以RT-PCR產(chǎn)物為模板，利用PCR方法將含有可供識(shí)別生物素化位點(diǎn)的15個(gè)氨基酸殘基序列(substrate peptide for BirA-dependent biotinylation, BSP)和甘氨酸-絲氨酸接頭的序列接在HLA-A0201胞外區(qū)的COOH端。分別將HLA-A0201-BSP和β-2m基因克隆入pBV220表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分析：分別在大約33kD和12kD處有一新生帶，與預(yù)期結(jié)果相符；經(jīng)凝膠成像儀分析軟件分析，pBV220-HLA-A0201-BSP和pBV220-β-2m的表達(dá)量分別占菌體總蛋白的46％和26％；經(jīng)可溶性分析顯示，pBV220-HLA-A0201-BSP和pBV220-β-2m主要以包涵體的形式存在，分別為90％和85％。 表達(dá)水平與誘導(dǎo)的時(shí)間和溫度相關(guān)。實(shí)驗(yàn)表明：最適的細(xì)菌生長(zhǎng)溫度為37℃，在該溫度下，大部分表達(dá)蛋白以包涵體形式存在；最適誘導(dǎo)溫度42℃，且誘導(dǎo)4小時(shí)與過(guò)夜誘導(dǎo)表達(dá)量沒(méi)有顯著性差異。同時(shí)為獲得目的蛋白的高效表 彥必丈學(xué)居學(xué)虎薄士探兌全筍世居戈. 叭戈有蘿 達(dá)，在不同表達(dá)載體和不同宿主菌中進(jìn)行了比較，在pET一30a(+)，pET一28b (+)，pET一22b(+)，pET42b(+)和pKKH中，pET一28b(+)表達(dá)量最高， 其次為pET一22b(+);而不同宿主菌間表達(dá)量并無(wú)明顯差異。 提取表達(dá)的HLA.A0201一BSP和你Zm蛋白的包涵體，洗滌、溶解后進(jìn)行純 化。根據(jù)等電點(diǎn)分析，首先采用5 Sepharose FF柱，收集穿過(guò)峰。再過(guò)Q Sepharose FF柱，利用NaCI梯度洗脫法收集50 mM NaCI所在峰。HLA一A0加卜 BsP再經(jīng)sephadex一G50柱進(jìn)行脫鹽。HLA一Ao加1一BsP是非可溶性蛋白，只有 在B一Zm存在下可復(fù)性。經(jīng)分析其純度為95%左右，濃度為1.5叭J;而0一Zm是 可溶性蛋白質(zhì)，脫鹽后繼續(xù)脫尿素。用sePhadex G-25柱進(jìn)一步脫鹽脫尿素， 尿素濃度由6mo鞏降至2 mo比，再以水透析。經(jīng)分析其純度為95%以上，濃 度為1.2叭;采用westem blot法來(lái)鑒定HLA一A0201一BsP和B.Zm的免疫學(xué)性 質(zhì)。雜交結(jié)果顯示誘導(dǎo)菌泳道中對(duì)應(yīng)HLA-AOZOI一BSP和仙.2m分子量處各有 一條較強(qiáng)的雜交帶，而只加未誘導(dǎo)菌體的泳道沒(méi)有雜交帶。 將純化好的HLA一A0201一BSP融合蛋白、B一Zm以及特異性膚(HBV/H CV) 折疊復(fù)合，形成HL左A0201一膚復(fù)合物，再以BirA酶作用于融合在HLA一A0201 蛋白C端BSp(substrate伴ptide for Bi叭一dePendent biotinylation)中的賴(lài)氨酸殘 基上，使其生物素化。生物素化的復(fù)合體再分別經(jīng)sephacryl一300和MonoQ柱 進(jìn)行純化。該復(fù)合物與藻紅蛋白標(biāo)記的親和素以4:1比例混合而構(gòu)建成四聚 體。用此四聚體標(biāo)記已分離好的PBMC，在流式細(xì)胞分析儀上進(jìn)行分析。在 急、慢性乙肝患者中，抗原特異性細(xì)胞毒CDS+T細(xì)胞的頻數(shù)分別為1 .84%和 0.02%司.68%，而在慢性丙型肝炎患者中為0.02刃.72%:同時(shí)，采用EUSPOT 方法檢測(cè)了抗原特異的IFN一丫分泌cDS+T細(xì)胞(個(gè)細(xì)胞/孔，2 x 106/ml/ 孔)。慢性乙肝患者組:特異性膚刺激組99.5肚42.08;非相關(guān)膚對(duì)照組 21 .0妊14.43;自身對(duì)照組20.78月2.32;特異性膚刺激組與非相關(guān)肚對(duì)照組和自 身對(duì)照組之間存在顯著差異(P0.01).慢性丙肝患者組:特異性膚刺激組 43.01土22.08;非相關(guān)膚對(duì)照組6雙汪4.43:自身對(duì)照組6，肚3.43;特異性膚刺激 組與非相關(guān)膚對(duì)照組和自身對(duì)照組之間存在顯著差異(P0.01)。健康對(duì)照 組:自身對(duì)照組、特異性膚刺激組與非相關(guān)膚對(duì)照組均在肚4.03之間，且各組 之間沒(méi)有顯著性差異�！� 磨邊才筍曹筍靂薄士好蕪生.筍世老戈‘ 本研究獲得HLA一A0201一BSP和價(jià)Zm蛋白的高效表達(dá)，為研究在原核系統(tǒng) 中表達(dá)、純化，以及進(jìn)一步利用親和素在體外構(gòu)建MHC一I類(lèi)分子四聚體，，研究 抗原特異性細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞功能等奠定基礎(chǔ)。構(gòu)建的此四聚體不僅為構(gòu)建其 他抗原特異性四聚體奠定基礎(chǔ)，而且也為臨床治療乙、丙型肝炎提供實(shí)驗(yàn)室依 據(jù)，并為臨床用
【學(xué)位授予單位】：延邊大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類(lèi)號(hào)】：R392

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前1條

1 李紹飛;MHC-肽四聚體的構(gòu)建及其技術(shù)改造研究[D];西南大學(xué);2007年

本文編號(hào)：2678397