【摘要】： 本論文的創(chuàng)新點(diǎn)在于建立一種以計(jì)算機(jī)模擬結(jié)果為理論依據(jù)從而指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和操作的技術(shù)方法，使其作為一種有力的工具用于分析蛋白的結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系(如抗體識(shí)別的抗原表位)、合理的藥物設(shè)計(jì)(如抗體的人源化改造)等研究。 以已有晶體結(jié)構(gòu)的人腫瘤壞死因子-α(hTNF-α)，作為研究靶抗原。hTNF-α在許多疾病的生理和病理反應(yīng)中都發(fā)揮關(guān)鍵作用，因而成為治療這些疾病的有效靶分子。抗hTNF-α中和性單抗作為hTNF-α活性的阻斷劑，已被用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、膿毒性休克和炎性腸病等疾病，在國(guó)際和國(guó)內(nèi)都有廣闊的發(fā)展前景。本室研制的小鼠抗hTNF-α單抗Z12，由于具有中和活性和較高親和力，因而具有理論研究和實(shí)際應(yīng)用意義。 抗原表位的確定和抗體的人源化改造是抗體研究工作的兩個(gè)主要方面，利用計(jì)算機(jī)模型可為上述工作提供極大的幫助。首先釣取了Z12抗體的可變區(qū)基因，利用同源模建、分子對(duì)接等方法，模擬了Z12 Fv的三維結(jié)構(gòu)和抗原抗體復(fù)合物模型，由后者預(yù)測(cè)抗體識(shí)別的抗原表位；隨后通過尋找抗原表位的實(shí)驗(yàn)研究，，確定了Z12抗體結(jié)合hTNF-α的主要部位(hTNF-α141-146)，并證實(shí)了計(jì)算機(jī)模型是可靠的；在認(rèn)為是可靠的計(jì)算機(jī)模型的基礎(chǔ)上，對(duì)Z12抗體的可變區(qū)進(jìn)行了合理的人源化設(shè)計(jì)(將VH骨架區(qū)中88位Ser突變?yōu)锳la，VL骨架區(qū)中17位Glu和18位Lys分別突變?yōu)锳sp和Arg)；最后完成人源化抗體基因的克隆、表達(dá)，活性研究的結(jié)果表明人源化抗體很好地保持了親本抗體的特異性和親和活性。通過以上研究，一方面確定了Z12抗體識(shí)別的抗原表位，另一方面獲得了有意義的人源化抗體，并申請(qǐng)了一項(xiàng)國(guó)內(nèi)發(fā)明專利。 本研究中的Z12抗體可變區(qū)基因序列由本室獲得，具有獨(dú)立的知識(shí)產(chǎn)權(quán)；抗體的可變區(qū)序列、抗體識(shí)別的抗原表位以及人源化改造方法與已公開發(fā)表的抗體均有所不同。
【圖文】：

抗體作用模式，通過親疏水性對(duì)hINF一a參與同抗體作用給出了抗原h(huán)TNF一a參與同212抗體作用的區(qū)域分布模TNF一a的141一146位為212抗體特異性識(shí)別的主要區(qū)域。圖L13參與同212抗體作用的hTNr一a區(qū)域(被212抗體識(shí)別的hTNF-a區(qū)域)模式圖Fig.l.13ThesketehmaPofhTNF一任areaswhiehinteraetwith212antibodyorarereeogn讓edby212antibody

pU詡F一a質(zhì)粒將被切成一條線形條帶。此外，由于Hindm的酶切位點(diǎn)(位于終止碼之后15個(gè)堿基位置處)依然存在，因此被其消化后，pUTNF92一157同pUINF一a質(zhì)粒一樣呈現(xiàn)一條線形條帶(見圖2.4A)。(A)M8(B)M910(C)叫~-377圖2.4重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig·2·4IdentifieationofreeombinantPlasmidbyrestrietionenZyme(A)pUTNF92一157的酶切鑒定(B)pu翎Fo53一91重組質(zhì)粒的酶切鑒定l:recombinantPlasmidofPUTNF92一157;8:PUTNFD53一9一/Ncol+從月dHI2:PUINF92一157/EcoNI;3:PUI，NF一a/ECoNI;(C)pUTNFD29一88重組質(zhì)粒的酶切鑒定4:pUTNF92一157/從”ell;9:PUTNFD29一88/Ncol+去幾月dlll:5:PUTNF一a/去刀刀e11:10:PU詡F一a/入七口I+勁刀dlll6:PUINF92一157/去廳”dlll:7:PUTNF一a/Hindlll:在pUINF一a質(zhì)粒中，編碼基因的起始碼之前和終止碼之后分別有Nc口I和Hindln酶切位點(diǎn)，用它們同時(shí)消化該質(zhì)粒可得到494bP的小片段。pU詡FD53一91和pUINFo29一88重組子分別缺失39aa(117bp)和6oaa(18obp)，因此用腸01和Hindln雙酶切兩質(zhì)粒后，將分別得到377bP(見圖2.4B)和314bP(見圖2.4c)的小片段。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2678226