【摘要】： 本論文的創(chuàng)新點在于建立一種以計算機模擬結果為理論依據(jù)從而指導實驗設計和操作的技術方法，使其作為一種有力的工具用于分析蛋白的結構-功能關系(如抗體識別的抗原表位)、合理的藥物設計(如抗體的人源化改造)等研究。 以已有晶體結構的人腫瘤壞死因子-α(hTNF-α)，作為研究靶抗原。hTNF-α在許多疾病的生理和病理反應中都發(fā)揮關鍵作用，因而成為治療這些疾病的有效靶分子�？筯TNF-α中和性單抗作為hTNF-α活性的阻斷劑，已被用于治療類風濕性關節(jié)炎、膿毒性休克和炎性腸病等疾病，在國際和國內(nèi)都有廣闊的發(fā)展前景。本室研制的小鼠抗hTNF-α單抗Z12，由于具有中和活性和較高親和力，因而具有理論研究和實際應用意義。 抗原表位的確定和抗體的人源化改造是抗體研究工作的兩個主要方面，利用計算機模型可為上述工作提供極大的幫助。首先釣取了Z12抗體的可變區(qū)基因，利用同源模建、分子對接等方法，模擬了Z12 Fv的三維結構和抗原抗體復合物模型，由后者預測抗體識別的抗原表位；隨后通過尋找抗原表位的實驗研究，，確定了Z12抗體結合hTNF-α的主要部位(hTNF-α141-146)，并證實了計算機模型是可靠的；在認為是可靠的計算機模型的基礎上，對Z12抗體的可變區(qū)進行了合理的人源化設計(將VH骨架區(qū)中88位Ser突變?yōu)锳la，VL骨架區(qū)中17位Glu和18位Lys分別突變?yōu)锳sp和Arg)；最后完成人源化抗體基因的克隆、表達，活性研究的結果表明人源化抗體很好地保持了親本抗體的特異性和親和活性。通過以上研究，一方面確定了Z12抗體識別的抗原表位，另一方面獲得了有意義的人源化抗體，并申請了一項國內(nèi)發(fā)明專利。 本研究中的Z12抗體可變區(qū)基因序列由本室獲得，具有獨立的知識產(chǎn)權；抗體的可變區(qū)序列、抗體識別的抗原表位以及人源化改造方法與已公開發(fā)表的抗體均有所不同。
【圖文】：

抗體作用模式，通過親疏水性對hINF一a參與同抗體作用給出了抗原h(huán)TNF一a參與同212抗體作用的區(qū)域分布模TNF一a的141一146位為212抗體特異性識別的主要區(qū)域。圖L13參與同212抗體作用的hTNr一a區(qū)域(被212抗體識別的hTNF-a區(qū)域)模式圖Fig.l.13ThesketehmaPofhTNF一任areaswhiehinteraetwith212antibodyorarereeogn讓edby212antibody

pU詡F一a質(zhì)粒將被切成一條線形條帶。此外，由于Hindm的酶切位點(位于終止碼之后15個堿基位置處)依然存在，因此被其消化后，pUTNF92一157同pUINF一a質(zhì)粒一樣呈現(xiàn)一條線形條帶(見圖2.4A)。(A)M8(B)M910(C)叫~-377圖2.4重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig·2·4IdentifieationofreeombinantPlasmidbyrestrietionenZyme(A)pUTNF92一157的酶切鑒定(B)pu翎Fo53一91重組質(zhì)粒的酶切鑒定l:recombinantPlasmidofPUTNF92一157;8:PUTNFD53一9一/Ncol+從月dHI2:PUINF92一157/EcoNI;3:PUI，NF一a/ECoNI;(C)pUTNFD29一88重組質(zhì)粒的酶切鑒定4:pUTNF92一157/從”ell;9:PUTNFD29一88/Ncol+去幾月dlll:5:PUTNF一a/去刀刀e11:10:PU詡F一a/入七口I+勁刀dlll6:PUINF92一157/去廳”dlll:7:PUTNF一a/Hindlll:在pUINF一a質(zhì)粒中，編碼基因的起始碼之前和終止碼之后分別有Nc口I和Hindln酶切位點，用它們同時消化該質(zhì)�？傻玫�494bP的小片段。pU詡FD53一91和pUINFo29一88重組子分別缺失39aa(117bp)和6oaa(18obp)，因此用腸01和Hindln雙酶切兩質(zhì)粒后，將分別得到377bP(見圖2.4B)和314bP(見圖2.4c)的小片段。
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R392

【參考文獻】

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本文編號：2678226