【摘要】：m6A是真核生物mRNA和IncRNA中含量最為豐富的一種修飾堿基。m6A影響mRNA的剪接、運(yùn)輸、翻譯和降解,參與脂肪生成、精子發(fā)生、發(fā)育、致癌、干細(xì)胞再生以及其他生命進(jìn)程。 FTO是第一個通過全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)與肥胖密切相關(guān)的基因,也是目前發(fā)現(xiàn)與肥胖相關(guān)性最強(qiáng)的易感基因。許多研究報道FTO與心血管疾病,Ⅱ型糖尿病,阿爾茨海默氏病和乳腺癌等多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。FTO基因編碼一種20G加氧酶,是第一個被發(fā)現(xiàn)的mRNAm6A去甲基化酶。本實(shí)驗(yàn)室在早期解析FTO蛋白與3-meT復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)(PDB:3LFM)的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步開展了對FTO抑制劑的設(shè)計合成和活性評價。根據(jù)FTO晶體結(jié)構(gòu),結(jié)合分子對接分析和高通量虛擬篩選后,設(shè)計了120種FTO抑制劑的備選化合物。 首先以3-meT為底物,對120種化合物進(jìn)行體外抑制FTO去甲基化酶活性的系統(tǒng)篩選,最后篩選得到3種結(jié)構(gòu)獨(dú)特的化合物,它們對FTO去甲基化酶活性有顯著影響,將其命名為C1、C2和C3。通過對這3種化合物的結(jié)構(gòu)比較和構(gòu)效分析,進(jìn)一步優(yōu)化出另外兩種化合物：C4和C5。然后分別以含：m6A的ssDNA和ssRNA為底物,對這5種化合物的FTO去甲基化酶活性的抑制作用進(jìn)行了系統(tǒng)檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn),這5種化合物對FTO的抑制活性均表現(xiàn)有濃度依賴性,FTO酶活性隨化合物的濃度升高而降低。其中C1對FTO抑制活性最高,C2次之,C5最低。以ALKBH2和ALKBH5為靶標(biāo)檢測不同抑制劑靶標(biāo)酶的選擇性。結(jié)果表明化合物C1和化合物C2也對ALKBH2去甲基活性有明顯抑制,化合物C1對ALKBH5有很強(qiáng)抑制作用。實(shí)驗(yàn)表明C1、C3、C4這3種化合物在細(xì)胞內(nèi)也有一定程度的去甲基化酶抑制活性。 ALKBH5與FTO均屬于AlkB家族成員。ALKBH5是第二個被發(fā)現(xiàn)的mRNA m6A去甲基化酶,在睪丸和肺中高表達(dá)；ALKBH5可以調(diào)控mRNA代謝和運(yùn)輸,并且與精子的生成密切相關(guān)。但是目前對ALKBH5如何識別mRNA上的m6A修飾及催化m6A去甲基化的分子機(jī)制仍不清楚。本文表達(dá)并純化了ALKBH5不同片段,通過懸滴法篩選得到了可以進(jìn)行衍射分析的ALKBH5晶體,在上海同步輻射光源收集到分辨率2.4A的衍射數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)分析顯示ALKBH5晶體屬于P212121空間群,一個不對稱單位含一個蛋白分子。由于利用分子置換法無法解析ALKBH5的晶體結(jié)構(gòu),正在嘗試?yán)肧e-MAD法解析ALKBH5的晶體結(jié)構(gòu)。
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R3411

【參考文獻(xiàn)】

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1 李曉紅;李蒙;陶艷蓉;;大黃酸及其衍生物藥理作用研究新進(jìn)展[J];現(xiàn)代藥物與臨床;2010年06期

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本文編號：2675044