【摘要】：近些年來,眾多的研究從分子、細(xì)胞和系統(tǒng)水平表明,細(xì)胞外ATP通過作用于P2嘌呤能受體在多種生理和病理過程中發(fā)揮著重要的作用。過去的十年,我們對(duì)于該類受體在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的功能有了越來越多的認(rèn)識(shí),研究發(fā)現(xiàn)它們?cè)诩?xì)胞增值、細(xì)胞遷移、神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的成熟和分化、細(xì)胞的死亡和生存中都發(fā)揮著一定的作用。 P2嘌呤能受體由兩大家族組成：離子通道型P2X家族(P2X1-7)和G蛋白偶聯(lián)受體P2Y家族(P2Y1,2,4,6,11,12,13,14)。已有一些工作初步研究了大鼠胚胎發(fā)育過程中P2X家族和P2Y家族在腦中的表達(dá)情況,然而除了P2X3和P2Y1亞型外,對(duì)于其他亞型的研究還較少。 P2X5受體存在于多種脊椎動(dòng)物中。既往的研究發(fā)現(xiàn)該類受體主要分布在皮膚、腸道、膀胱、胸腺和脊髓等部位的處于增值狀態(tài)的細(xì)胞中,主要作用是參與抑制細(xì)胞增值從而促進(jìn)細(xì)胞分化。神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中涉及大量的細(xì)胞增值、細(xì)胞分化等生理過程,提示P2X5受體可能參與了此過程。 我們的工作首先分析了小鼠出生前的四個(gè)時(shí)間點(diǎn)(E9、E11、E13、E17)的腦提取物中P2X5受體的mRNA和蛋白的表達(dá)情況。利用RT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)在四個(gè)時(shí)間點(diǎn)均可以在323bp位置檢測(cè)到明顯的條帶,表達(dá)量也存在明顯的變化趨勢(shì)——從E9到E13逐漸增加,從E13到E17逐漸下降。利用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),從E9開始在35KD位置均能檢測(cè)到單一條帶,表達(dá)量也呈現(xiàn)從E9到E13逐漸增加而從E13到E17逐漸下降的趨勢(shì)。 在小鼠出生前的五個(gè)時(shí)間點(diǎn)(E8、E9、E11、E13、E17)取材進(jìn)行免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在神經(jīng)管剛剛形成的E8時(shí)就可以檢測(cè)到P2X5的存在,該強(qiáng)烈的陽性信號(hào)主要分布在神經(jīng)上皮層。在E11時(shí),后腦、中腦和前腦區(qū)域均發(fā)現(xiàn)很強(qiáng)的陽性染色。但隨著腦的發(fā)育,陽性信號(hào)逐漸局限在新生神經(jīng)元開始分化的皮質(zhì)板位置。同樣在脊髓處,可以發(fā)現(xiàn)相似的表達(dá)情況。在E9時(shí),陽性信號(hào)在整個(gè)脊髓區(qū)域都可以檢測(cè)到；但隨著發(fā)育的進(jìn)行,陽性信號(hào)逐漸局限到腹側(cè)角位置。 先前的工作發(fā)現(xiàn)P2X5受體在成體哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要分布在神經(jīng)元中,因此我們使用神經(jīng)元的標(biāo)記物TUJ-1抗體進(jìn)行免疫雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)以確定P2X5陽性細(xì)胞的類型。在E8時(shí)的神經(jīng)管中,只有極少量(不到5%)的P2X5陽性信號(hào)與TUJ-1陽性信號(hào)共標(biāo),同樣在E9時(shí)的脊髓中發(fā)現(xiàn)了相似的情況。然而,在E11時(shí)的皮質(zhì)板和腹側(cè)角區(qū)域,絕大多數(shù)P2X5陽性信號(hào)與TUJ-1陽性信號(hào)共標(biāo)。 在小鼠的背根神經(jīng)節(jié)中,從E9時(shí)開始發(fā)現(xiàn)P2X5受體均一地表達(dá)在DRG神經(jīng)元中,而且所有的P2X5陽性信號(hào)與TUJ-1陽性信號(hào)共標(biāo)。在E11時(shí)視網(wǎng)膜的神經(jīng)細(xì)胞層和視神經(jīng)中均可以檢測(cè)到P2X5受體的強(qiáng)信號(hào),而且絕大多數(shù)的P2X5陽性信號(hào)與TUJ-1陽性信號(hào)共標(biāo)。在腸道中,所有的P2X5陽性信號(hào)與TUJ-1陽性信號(hào)共標(biāo)。在嗅上皮中也檢測(cè)到P2X5受體的強(qiáng)信號(hào)。另外,很強(qiáng)的P2X5陽性信號(hào)也存在于內(nèi)耳和前肢骨骼肌上散在的神經(jīng)纖維中。 既往的研究發(fā)現(xiàn)ATP等激動(dòng)劑刺激P2X5受體僅能產(chǎn)生極小的電流,但是該受體與P2X1受體形成的異源多聚體P2X1/5卻具有對(duì)于ATP的高敏感性、不易敏化等特點(diǎn)。為了研究P2X5受體的生理功能,我們首先需要確定在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中P2X5受體是否可以與P2X1受體形成異源多聚體。我們也利用RT-PCR、Western Blot、免疫組織化學(xué)技術(shù)等技術(shù)研究了P2X1受體在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程(Ell、E14、P0、P21)中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)該受體從E11時(shí)開始表達(dá)在神經(jīng)系統(tǒng)中。這種分布上的重疊現(xiàn)象提示兩受體之前存在形成異源多聚體的可能性。進(jìn)一步利用免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),P2X1和P2X5可以共沉淀。這些實(shí)驗(yàn)提示P2X5受體可能與P2X1受體形成異源多聚體來發(fā)揮生理功能。 本研究首次報(bào)道了神經(jīng)發(fā)育過程中P2X5受體和P2X1受體在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)P2X5受體在神經(jīng)發(fā)育的早期階段一過性的高表達(dá),并逐步局限到新生神經(jīng)元中,并發(fā)現(xiàn)P2X5受體和P2X1受體可能以P2X1/5異源多聚體的形式發(fā)揮作用。本工作豐富了對(duì)于P2受體各亞型在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中時(shí)空表達(dá)的認(rèn)識(shí),并為該類受體的功能研究提供了更多的信息。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R338

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本文編號(hào)：2674203