發(fā)布時間：2020-05-21 11:17

【摘要】：近些年來,眾多的研究從分子、細胞和系統(tǒng)水平表明,細胞外ATP通過作用于P2嘌呤能受體在多種生理和病理過程中發(fā)揮著重要的作用。過去的十年,我們對于該類受體在神經系統(tǒng)發(fā)育中的功能有了越來越多的認識,研究發(fā)現(xiàn)它們在細胞增值、細胞遷移、神經元和膠質細胞的成熟和分化、細胞的死亡和生存中都發(fā)揮著一定的作用。 P2嘌呤能受體由兩大家族組成：離子通道型P2X家族(P2X1-7)和G蛋白偶聯(lián)受體P2Y家族(P2Y1,2,4,6,11,12,13,14)。已有一些工作初步研究了大鼠胚胎發(fā)育過程中P2X家族和P2Y家族在腦中的表達情況,然而除了P2X3和P2Y1亞型外,對于其他亞型的研究還較少。 P2X5受體存在于多種脊椎動物中。既往的研究發(fā)現(xiàn)該類受體主要分布在皮膚、腸道、膀胱、胸腺和脊髓等部位的處于增值狀態(tài)的細胞中,主要作用是參與抑制細胞增值從而促進細胞分化。神經系統(tǒng)發(fā)育過程中涉及大量的細胞增值、細胞分化等生理過程,提示P2X5受體可能參與了此過程。 我們的工作首先分析了小鼠出生前的四個時間點(E9、E11、E13、E17)的腦提取物中P2X5受體的mRNA和蛋白的表達情況。利用RT-PCR技術發(fā)現(xiàn)在四個時間點均可以在323bp位置檢測到明顯的條帶,表達量也存在明顯的變化趨勢——從E9到E13逐漸增加,從E13到E17逐漸下降。利用蛋白印跡實驗發(fā)現(xiàn),從E9開始在35KD位置均能檢測到單一條帶,表達量也呈現(xiàn)從E9到E13逐漸增加而從E13到E17逐漸下降的趨勢。 在小鼠出生前的五個時間點(E8、E9、E11、E13、E17)取材進行免疫組織化學實驗發(fā)現(xiàn),在神經管剛剛形成的E8時就可以檢測到P2X5的存在,該強烈的陽性信號主要分布在神經上皮層。在E11時,后腦、中腦和前腦區(qū)域均發(fā)現(xiàn)很強的陽性染色。但隨著腦的發(fā)育,陽性信號逐漸局限在新生神經元開始分化的皮質板位置。同樣在脊髓處,可以發(fā)現(xiàn)相似的表達情況。在E9時,陽性信號在整個脊髓區(qū)域都可以檢測到；但隨著發(fā)育的進行,陽性信號逐漸局限到腹側角位置。 先前的工作發(fā)現(xiàn)P2X5受體在成體哺乳動物中樞神經系統(tǒng)中主要分布在神經元中,因此我們使用神經元的標記物TUJ-1抗體進行免疫雙標實驗以確定P2X5陽性細胞的類型。在E8時的神經管中,只有極少量(不到5%)的P2X5陽性信號與TUJ-1陽性信號共標,同樣在E9時的脊髓中發(fā)現(xiàn)了相似的情況。然而,在E11時的皮質板和腹側角區(qū)域,絕大多數P2X5陽性信號與TUJ-1陽性信號共標。 在小鼠的背根神經節(jié)中,從E9時開始發(fā)現(xiàn)P2X5受體均一地表達在DRG神經元中,而且所有的P2X5陽性信號與TUJ-1陽性信號共標。在E11時視網膜的神經細胞層和視神經中均可以檢測到P2X5受體的強信號,而且絕大多數的P2X5陽性信號與TUJ-1陽性信號共標。在腸道中,所有的P2X5陽性信號與TUJ-1陽性信號共標。在嗅上皮中也檢測到P2X5受體的強信號。另外,很強的P2X5陽性信號也存在于內耳和前肢骨骼肌上散在的神經纖維中。 既往的研究發(fā)現(xiàn)ATP等激動劑刺激P2X5受體僅能產生極小的電流,但是該受體與P2X1受體形成的異源多聚體P2X1/5卻具有對于ATP的高敏感性、不易敏化等特點。為了研究P2X5受體的生理功能,我們首先需要確定在神經系統(tǒng)發(fā)育過程中P2X5受體是否可以與P2X1受體形成異源多聚體。我們也利用RT-PCR、Western Blot、免疫組織化學技術等技術研究了P2X1受體在神經系統(tǒng)發(fā)育過程(Ell、E14、P0、P21)中的表達,發(fā)現(xiàn)該受體從E11時開始表達在神經系統(tǒng)中。這種分布上的重疊現(xiàn)象提示兩受體之前存在形成異源多聚體的可能性。進一步利用免疫共沉淀實驗發(fā)現(xiàn),P2X1和P2X5可以共沉淀。這些實驗提示P2X5受體可能與P2X1受體形成異源多聚體來發(fā)揮生理功能。 本研究首次報道了神經發(fā)育過程中P2X5受體和P2X1受體在中樞和外周神經系統(tǒng)中的表達情況,發(fā)現(xiàn)P2X5受體在神經發(fā)育的早期階段一過性的高表達,并逐步局限到新生神經元中,并發(fā)現(xiàn)P2X5受體和P2X1受體可能以P2X1/5異源多聚體的形式發(fā)揮作用。本工作豐富了對于P2受體各亞型在神經系統(tǒng)發(fā)育中時空表達的認識,并為該類受體的功能研究提供了更多的信息。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R338

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本文編號：2674203