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人低分子量雙特異性磷酸酶基因LMW-DSP2、LMW-DSP3的克隆與功能研究

發(fā)布時間：2020-05-21 09:33

【摘要】： 雙特異性磷酸酶能夠使磷酸化的酪氨酸殘基和絲/蘇氨酸殘基去磷酸化，在有絲分裂、信號傳導(dǎo)、胞外刺激和細(xì)胞周期等通路中發(fā)揮重要作用。通過大規(guī)模人類cDNA測序，我們從胎腦cDNA文庫中克隆了兩條低分子量的雙特異性磷酸酶基因。我們對兩條雙特異性磷酸酶基因進(jìn)行了生物信息學(xué)分析和功能研究。其中LMW-DSP2的cDNA具有1037個堿基，擬編碼的蛋白具有184個氨基酸，具有一個雙特異性磷酸酶的催化結(jié)構(gòu)域。蛋白產(chǎn)物的分子量為20.9 kDa，等電點為8.09。LMW-DSP2與小鼠中的同源蛋白具有96.7%的同源度。LMW-DSP2基因定位于6p22，該區(qū)段的染色體異常與多種白血病、間皮瘤、腺癌、淋巴瘤，骨髓瘤有關(guān)。LMW-DSP2基因具有8個外顯子和7個內(nèi)含子，所有外顯子與內(nèi)含子的接頭都符合AG-GT規(guī)則，在染色體上跨度58kb。LMW-DSP2同源的EST，它們分布于胎盤、肺、腦、胰腺、腸、睪丸、骨髓、皮膚、子宮、乳房等組織。Northern Blot結(jié)果顯示LMW-DSP2在心臟，骨骼肌和胰臟中有表達(dá)，檢測到1.8kb，2.0kb，4.0kb三個轉(zhuǎn)錄本。4.0 kb在心臟，骨骼肌和胰臟均有表達(dá)；1.8 kb在心臟和胰臟中表達(dá)；而2.0 kb僅在骨骼肌中表達(dá)。SAGE結(jié)果表明LMW-DSP2基因在腫瘤細(xì)胞和組織中廣泛表達(dá)。GST-LMW-DSP2融合蛋白具有對pNPP的磷酸酶活性，其最適pH值是7.0，最適溫度是37℃，磷酸酶抑制劑釩酸鈉能夠完全抑制LMW-DSP2的磷酸酶活性。Cys88和Asp57高度保守，任一位點的突變都會使磷酸酶活性急劇下降。LMW-DSP2蛋白能夠使磷酸化的酪氨酸殘基和絲/蘇氨酸殘基去磷酸，表明其是一個雙特異性磷酸酶。通過酵母雙雜交篩選人類胎腦文庫，發(fā)現(xiàn)LMW-DSP2蛋白與參加囊泡運(yùn)輸?shù)腞AB11A具有相互作用。LMW-DSP2蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均有分布，對JNK的磷酸化具有促進(jìn)作用。 LMW-DSP3基因cDNA具有1444個堿基，擬編碼的蛋白具有217個氨基酸。該蛋白具有雙特異性磷酸酶的催化結(jié)構(gòu)域，但沒有CDC25同源結(jié)構(gòu)域，是一個低分子量的雙特異性磷酸酶。蛋白分子量是24.2kDa，等電點是6.36，與小鼠LMW-DSP3具有84%的同源度。LMW-DSP3基因定位于2q32，該區(qū)域與骨髓瘤，貧血癥，淋巴瘤，白血病等疾病相關(guān)。LMW-DSP3具有5個外顯子和4個內(nèi)含子，在染色體上跨度21kb。Northern Blot結(jié)果沒有特異條帶，RT-PCR結(jié)果顯示LMW-DSP3在心、肺、肝和胰腺中有表達(dá)，其中在胰腺的表達(dá)量最高。LMW-DSP3在L0-2正常肝細(xì)胞和SMMC-7721肝癌細(xì)胞中有表達(dá)，而在肝癌 WP=5 細(xì)胞BEL-7402和QGY-7701中沒有表達(dá)。6His-LMW-DSP3的表達(dá)產(chǎn)物形成包涵體，未能獲得可溶蛋白。GST-LMW-DSP3融合蛋白具有對pNPP的磷酸酶活性，其最適pH值是7.0，最適溫度是37℃，LMW-DSP3的磷酸酶活性不依賴于二價陽離子，Ca2+和Mn2+對磷酸酶活性具有輕微的促進(jìn)作用。釩酸納能夠完全抑制LMW-DSP3的磷酸酶活性。通過酵母雙雜交篩選人類胎腦文庫，發(fā)現(xiàn)LMW-DSP3蛋白與一個具有TB2-DP1-HVA22結(jié)構(gòu)域的蛋白具有相互作用。LMW-DSP3蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)中。Cys150和Asp119高度保守，突變都會導(dǎo)致磷酸酶活性急劇下降。LMW-DSP3蛋白能夠使磷酸化的酪氨酸殘基和絲/蘇氨酸殘基去磷酸，，表明其是一個雙特異性磷酸酶。在293細(xì)胞中，LMW-DSP3蛋白能夠抑制JNK的活性，說明它是一個新的MAPK磷酸酶。
【圖文】：

染色體定位,基因定位