【摘要】：目的：抗菌肽在機(jī)體防御中起重要作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)包括cathelicidin多種抗菌肽。Cathelicidin是由保守的N末端及可變的C末端組成,蛋白酶切割前體形成。LL-37是人體內(nèi)唯一的cathelicidin。LL-37由37個氨基酸組成,呈螺旋狀,有親水和疏水部分,具有廣譜抗菌活性。LL-37的防御作用包括調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng),趨化免疫細(xì)胞至損傷或感染部位,結(jié)合并中和LPS,促進(jìn)再上皮化及損傷修復(fù)。本研究通過建立LTA誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥模型,分析炎癥時LL-37的變化,探討LL-37在LTA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥中的作用及機(jī)制。 方法：LTA(2ug/ml)刺激巨噬細(xì)胞系RAW264.7和C57BL/6小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞,建立炎癥的細(xì)胞模型。以ELISA及實時定量PCR方法測定炎癥因子的表達(dá),以免疫熒光檢測LL-37的細(xì)胞定位,聯(lián)合Western blot方法檢測LL-37在炎癥時的變化,以Western blot檢測LL-37對LTA誘導(dǎo)的炎癥的作用機(jī)制。 結(jié)果： 1.LL-37細(xì)胞定位 以免疫熒光證實LL-37是否存在于巨噬細(xì)胞中及在巨噬細(xì)胞中的分布。結(jié)果顯示LL-37主要分布在細(xì)胞質(zhì)中。 2.LTA誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng) 以不同濃度來源于金黃色葡萄球菌的LTA刺激RAW264.7及原代小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,通過ELISA檢測培養(yǎng)基中TNF-a的水平,確定LTA是否可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)及LTA的最佳濃度。在RAW264.7細(xì)胞系中,當(dāng)LTA濃度從0至2ug/mL時,TNF-α濃度由4.56±0.89升高到7.49±1.80ng/L,在小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中,則由5.18±0.91升至11.22±0.88ng/L。但當(dāng)LTA濃度為5-20ug/mL時能夠引起急性細(xì)胞壞死,從而導(dǎo)致TNF-α表達(dá)降低。結(jié)果提示0至2ug/mL的LTA可以誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng),但過高濃度的LTA導(dǎo)致細(xì)胞損傷和死亡 3.LL-37在LTA誘導(dǎo)的RAW264.7炎癥中的表達(dá) 以免疫熒光及Western blot方法檢測在LTA誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎癥中LL-37的表達(dá)情況。將化學(xué)合成的LL-37加入到RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)基中以免疫熒光及Western blot檢測檢測LL-37的攝取效率。本實驗分4組：對照組,LL-37干預(yù)組,LTA干預(yù)組及LTA與LL-37同時干預(yù)組。LTA干預(yù)組LL-37表達(dá)比對照組增加1.33±0.13倍,有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。LTA與LL-37同時干預(yù)組LL-37表達(dá)比對照組增加1.93±0.18倍,有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。LTA與LL-37同時干預(yù)組中,LL-37的表達(dá)較LTA干預(yù)組明顯升高,有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),但與LL-37干預(yù)組無明顯差異(p0.05)。由此提示LTA可以誘導(dǎo)LL-37的表達(dá),LL-37可以透膜進(jìn)入RAW264.7細(xì)胞。 4.LL-37可以減弱由LTA誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng) 通過ELISA方法檢測是否LL-37可以減弱由LTA誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞及原代小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。首先以2ug/mL的LTA誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞及小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥。隨后以0-40ug/mL的LL-37干預(yù)。結(jié)果顯示：在RAW264.7細(xì)胞中,1-15ug/mL的LL-37以濃度依賴的方式降低TNF-α的表達(dá),TNF-α濃度由基礎(chǔ)值6.46±0.36ng/L降低至4.63±0.81ng/L, LL-37的最適濃度為15ug/mL;而在小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞中,1-10ug/mL的LL-37以濃度依賴的方式降低TNF-α的表達(dá),TNF-α濃度由基礎(chǔ)值10.52±0.92ng/L降低至6.69±0.64ng/L, LL-37的最適濃度為10ug/mL。結(jié)果所示,若LL-37濃度超過最適濃度,則可導(dǎo)致細(xì)胞損傷,增加TNF-α釋放。因此適當(dāng)濃度的LL-37可以減弱LTA誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng),但是過高濃度則可以導(dǎo)致細(xì)胞損傷。本實驗以15ug/mL的LL-37干預(yù)RAW264.7細(xì)胞,以10ug/mLELISA的LL-37干預(yù)小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞。 5.LL-37可以通過降低炎癥因子的表達(dá)減弱LTA誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)TNF-α及IL-6是炎癥中的主要炎癥因子。我們通過實時定量PCR檢測RAW264.7細(xì)胞中及ELISA檢測小鼠原代巨噬細(xì)胞培養(yǎng)基中的TNF-α及IL-6表達(dá)來證明LL-37是否可以通過降低炎癥因子的表達(dá)減弱LTA誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)。結(jié)果顯示：在RAW264.7細(xì)胞中與對照組比較,LTA干預(yù)組中,TNF-α及IL-6的mRNA分別增加8.75±0.47倍及34.12±9.68倍；與LTA干預(yù)組比較,LTA和LL-37同時干預(yù)組TNF-α及IL-6的mRNA明顯降低。提示LL-37可以明顯降低TNF-α及IL-6的mRNA表達(dá)水平。在小鼠原代巨噬細(xì)胞中,與對照組比較,LTA干預(yù)組中,TNF-α及IL-6的濃度分別由基礎(chǔ)值的4.98±1.30ng/L,16.75±9.06ng/L增加至7.53±2.21ng/L,180.38±29.46ng/L;與LTA干預(yù)組比較,LTA和LL-37同時干預(yù)組TNF-a及IL-6的濃度明顯降低。因此LL-37可以通過降低炎癥因子TNF-a及IL-6的表達(dá)減弱LTA誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。 6.LL-37通過抑制p38MAPK及Akt的磷酸化抑制LTA誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng) 通過驗證RAW264.7細(xì)胞及小鼠原代巨噬細(xì)胞中p38MAPK及Akt的磷酸化水平檢測LL-37的信號通路。結(jié)果顯示：LTA通過增加巨噬細(xì)胞p38MAPK及Akt的磷酸化水平促進(jìn)炎癥產(chǎn)生；LL-37通過抑制巨噬細(xì)胞p38MAPK及Akt的磷酸化水平抑制LTA誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥產(chǎn)生。 結(jié)論： 1.在LTA誘導(dǎo)的金黃色葡萄球菌感染的巨噬細(xì)胞炎癥模型中,TNF-α、IL-6及LL-37表達(dá)水平上升,提示LTA可以引起巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng),LL-37參與LTA引起的炎癥反應(yīng)。 2.LL-37降低炎癥因子表達(dá),提示LL-37可以緩解炎癥反應(yīng)。 3.LTA可以促進(jìn)p38及Akt磷酸化,LL-37可以抑制p38及Akt的磷酸化,提示LL-37可以通過抑制p38及Akt磷酸化參與LTA誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R378.11

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本文編號：2673539