【摘要】：研究背景高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡是糖尿病血管病變的重要環(huán)節(jié),但其機(jī)制尚未闡明,普遍認(rèn)為,高糖誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡與活性氧(ROS)生成過量、清除減少,導(dǎo)致氧化應(yīng)激有關(guān)。我們最近的工作得出,高糖條件下,人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞TL1A表達(dá)明顯增多。TL1A作為一種新近發(fā)現(xiàn)的促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的細(xì)胞因子,是否通過ROS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,目前國內(nèi)外未見相關(guān)報道。 目的觀察TL1A對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞活性氧生成的影響,探討TL1A在高糖誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中的作用及其機(jī)制。 方法1.以不同濃度(5.6mM,11.2 mM, 22.4 mM,33.6 mM)葡萄糖孵育人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞24h,或以22.4 mM葡萄糖培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞不同時間(0h, 6h, 12h, 24h, 48h),Western bloting檢測各組內(nèi)皮細(xì)胞TL1A蛋白的表達(dá)。2.將孵育的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分為正常對照組、正常糖+TL1A組、高糖對照組、高糖+SOD+CAT組、高糖+TL1A抗體1μg/ml組、高糖+TL1A抗體3μg/ml組、高糖+TL1A抗體9μg/ml組和高滲對照組。DCFH-DA染色法觀察活性氧生成較多的細(xì)胞數(shù),并采用流式細(xì)胞術(shù)檢測人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成量; Annexin V/PI熒光雙染色、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率;酶標(biāo)法檢測caspase-3的活性。 結(jié)果高糖條件下,人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞TL1A蛋白表達(dá)顯著增高(P0.01),且呈時間和濃度依賴性。與正常對照組相比,高糖組人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成量明顯增加,76.96±6.61vs 46.80±4.10(P0.01),正常糖+TL1A組ROS生成量達(dá)93.75±9.12,為正常對照組的2倍,也顯著高于高糖對照組(P0.01),高糖培養(yǎng)液中加入TL1A抗體,ROS生成量呈劑量依賴性減少,高糖+TL1A抗體9μg/ml組內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成量與高糖+SOD+CAT組和正常對照組相近;染色法檢測HUVECs活性氧生成較多的細(xì)胞數(shù)結(jié)果與前述變化趨勢一致。正常對照組細(xì)胞凋亡率為4.09%±0.39%,高糖對照組細(xì)胞凋亡率為23.70%±3.20%(P0.01);正常糖+TL1A組細(xì)胞凋亡率達(dá)正常對照組的8.6倍,為高糖對照組的1.5倍(P0.01);TL1A抗體呈劑量依賴性減少血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡率,其中高糖+TL1A抗體9μg/ml組細(xì)胞凋亡率與高糖+SOD+CAT組和正常對照組相近;高滲透壓不引起細(xì)胞凋亡。Caspase-3活性變化趨勢與細(xì)胞凋亡率變化結(jié)果相近。 結(jié)論高糖上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞TL1A的表達(dá),TL1A增加血管內(nèi)皮細(xì)胞活性氧生成介導(dǎo)高糖所致的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。
【圖文】：

實 驗 結(jié) 果1.高糖條件下人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞TL1A的表達(dá)1.1不同濃度葡萄糖對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞TL1A表達(dá)的影響分別以5.6mM、11.2 mM、22.4 mM和33.6 mM葡萄糖培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)24h, 以5.6 mM葡萄糖+28 mM甘露醇作為高滲透壓對照，Western bloting檢測臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞TL1A蛋白的表達(dá)，結(jié)果見圖1。用11.2 mM、22.4 mM和33.6 m葡萄糖培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞24h，內(nèi)皮細(xì)胞TL1A的表達(dá)顯著高于5.6mM葡萄培養(yǎng)的對照組（P＜0.01），其中22.4 mM葡萄糖培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞TL表達(dá)最高。說明高糖上調(diào)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞TL1A表達(dá)。高滲對照的人臍靜脈皮細(xì)胞TL1A表達(dá)也有所增多，但與對照相比，不具統(tǒng)計學(xué)差異。

圖2.22.4mM葡萄糖培養(yǎng)HUVEC不同時間TL1A蛋白的表達(dá)（n=3）* P＜0.01，與0h比較2. TL1A對高糖所致HUVECs ROS生成的影響2.1 DCFH-DA染色法檢測HUVECs活性氧生成較多的細(xì)胞數(shù)以5.6mM葡萄糖孵育人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞24h，顯示紅染的細(xì)胞數(shù)少；于5.6mM葡萄糖孵育人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞加入50ng/ml TL1A，紅染的細(xì)胞數(shù)量顯著增多，說明TL1A能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞活性氧生成增多；以22.4mM葡萄糖孵育人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞24h，紅染的細(xì)胞數(shù)也顯著多于正常對照組，表明高糖顯著增加內(nèi)皮細(xì)胞活性氧生成；于高糖培養(yǎng)液中加入超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（CAT），紅染的細(xì)胞數(shù)較高糖對照組顯著減少，略多于正常對照組；而于高糖培養(yǎng)液中分別加入TL1A單克隆抗體1μg/ml, 3μg/ml, 9μg/ml，紅染的細(xì)胞數(shù)呈濃度依賴性減少，當(dāng)TL1A單克隆抗體濃度增至9μg/ml時，，可見紅染的細(xì)胞數(shù)量顯
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R363

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本文編號：2673260