【摘要】：研究背景及研究目的: 嚴重創(chuàng)傷、感染、腫瘤切除、骨病等原因所致的骨缺損在臨床治療中非常常見,嚴重的骨缺損用現(xiàn)有的方法(如自體骨移植、異體骨移植、人工假體等)難以獲得滿意的療效。而骨組織工程理論上可以完全再生原有組織,被認為是修復骨缺損理想的方法,在將來的臨床中具有廣闊的應用前景。骨組織工程是體外將種子細胞種植到可吸收生物支架上后移植到體內修復骨缺損的方法,其中種子細胞是最重要的環(huán)節(jié)之一。 骨髓間充質干細胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cell,MSCs)被認為是骨組織工程最佳的種子細胞。因為這種細胞不僅在體外增殖能力比成骨細胞強得多;而且具有多向分化潛能,在體內外成骨誘導環(huán)境下可分化為骨組織;另外,這種細胞也較容易分離和培養(yǎng)。雖然目前還沒有找到MSCs特異的表面標志,但普遍認為MSCs形態(tài)呈梭形、貼壁生長、類似纖維細胞但與其功能完全不同;在第一、二代分別約95%、98%細胞的表型一致,為:SH2、SH3、CD29、CD90、CD106等陽性,CD34、CD45、CD14陰性;強陽性表達Stro-1,95%以上CD105表達陽性。應用MSCs作為骨組織工程種子細胞的研究很多,在自體移植修復骨缺損動物模型和異基因移植修復免疫缺陷動物骨缺損模型實驗中取得了良好的效果。但MSCs在骨髓中含量很少,并隨著年齡的增長減少;現(xiàn)有方法體外迅速擴增困難。因此,自體MSCs的應用會受來源和數(shù)量限制,難以滿足臨床治療的需要。 異基因MSCs來源及數(shù)量不受限制,可能作為骨組織工程種子細胞的另一個來源。然而,如果受體不進行免疫抑制治療,異基因組織、細胞的移植必然會導致免疫排斥反應。這是由供體與宿主DNA多態(tài)性位點上不同的等位基因所編碼的組織相容性抗原所決定的。另一方面,MSCs雖然表達MHCⅠ類分子和粘附分子ICAM、VCAM、LFA-3;但其只表達極少量的MHCⅡ類分子,不表達B7-1、B7-2和CD40、CD40L。這種特性決定了MSCs較低的免疫原性,可能有利于它的存活。研究表明:小劑量 國家自然科學青年基金資助項目(NO.30300090) 國家重點實驗室開放課題基金資助項目 WP=13 MSCs可以刺激T淋巴細胞增生;大劑量MSCs則抑制ConA刺激的T淋巴細胞增生以及異基因混合淋巴細胞反應。未分化的MSCs在移植入人和動物體內都顯示出了較好的耐受;但其分化后代則被緩慢排斥。有人將轉染了BMP2的異基因MSCs作為種子細胞,在修復小鼠股骨骨缺損動物模型中,短期應用免疫抑制劑(FK506)的條件下獲得了與自體移植相當?shù)某晒切Ч?異基因MSCs作為骨組織工程種子細胞,必須首先減輕免疫排斥反應。免疫排斥是異基因器官和組織移植最大的障礙和最難解決的問題,目前還沒有任何方法可以誘導特異的、完全的、終身的免疫耐受。在免疫耐受研究中,對CTLA4的研究取得了顯著的進展和顯示了廣闊的前景。CTLA4(Cytotoxic Lymphocyte Antigen 4,CTLA4)是在CTL細胞中發(fā)現(xiàn)的第四種特異性抗原基因編碼的糖蛋白,它主要表達在活化的T 細胞上。可競爭性抑制APC 膜上的B7分子與T細胞膜上的CD28結合,從而阻斷T 細胞的完全活化。CTLA4Ig是由CTLA4胞外區(qū)與IgG Fc 段融合而成,具有與CTLA4幾乎相同的生物學功能。大量實驗證實:CTLA4Ig具有誘導特異性免疫耐受的功能,雖然并不是完全的免疫耐受。因此,我們設想用CTLA4Ig基因轉染MSCs,通過細胞表達CTLA4Ig阻斷T細胞完全活化所需的輔助信號途徑,減輕免疫排斥反應,促進基因修飾MSCs(MSCs-C)及其分化后代在宿主體內的存活。 另一方面,MSCs-C要作為種子細胞,必須在體外具有旺盛的增殖能力和保持分化潛能。由于基因修飾后篩選穩(wěn)定整合的克隆需要多次傳代;而MSCs在體外只有20-30PD的生命期和在傳代中分化潛能逐漸減弱可能滿足不了需要。因此,要對MSCs進行基因修飾并篩選克隆,可能首先應當延長其體外培養(yǎng)生命期并保持分化潛能。人們對端粒酶的研究使這一設想成為可能。研究表明:端粒酶催化亞單位(hTERT)的活性與端粒的長度呈正相關,并在細胞永生化和分化中起重要作用;而且,異位表達hTERT在很多細胞中都可以延長細胞壽命。Simonsen JL等將hTERT轉入hMSCs篩選到的hMSCs-T細胞克隆在體外培養(yǎng)200PD以上,細胞未發(fā)現(xiàn)明顯的衰老現(xiàn)象、保持了多向分化潛能并沒有致瘤傾向。這說明用hTERT轉染修飾hMSCs可以達到延長hMSCs生命周期、保持多向分化潛能的結果。 基于上述認識,本課題擬應用逆轉錄病毒將hCTLA4Ig基因導入人骨髓間充質干細胞,并篩選獲得MSCs-C細胞克隆或細胞群;研究基因修飾MSCs成骨分化潛能和減輕免疫排斥反應情況,觀察其作為異基因種子細胞體內成骨能力。從理論上講,這種細胞既可能保持成骨分化潛能;又可能通過表達CTLA4Ig控制免疫排斥反應。這種特性更有利于MSCs-C的定植,可能對免疫排斥反應不強的異基因MSCs移植是足夠 WP=14 的。從而使異基因MSCs-C作為骨組織工程的種子細胞成為可能,為解決骨組織工程種子細胞來源提供一種新的方法,拓寬骨組織工程的應用范圍。另外,我們還擬構建hTERT-真核表達載體并轉染MSCs以延長其生命期,為將來獲得雙基因修飾骨髓間充質干細胞克隆:MSCs-T-C細胞克隆奠定基礎,爭取建立一種骨組織工程標準細胞系。 實驗方法 1、應用XhoI、StuI酶切鑒定pLXSN-CTLA4Ig-IRES2-EGFP重組質粒;Nucleofecto
【圖文】：

的抗 CTLA4 抗體至終濃度 5μg胞懸浮于含 1%多聚甲醛的 PBA抗體作為對照。結 果IRES2-EGFP 重組質粒酶切鑒定S2-EGFP (PLCIE)重組載體經(jīng) X儀上觀察可見一條 3.6kb 的目的kb 單一片斷(見圖 1)。與預期的結1 2 3 4

代細胞 FACS 檢測結果顯示：分離培養(yǎng)的細胞 94.59%CD105 表達陽性，，97.58%CD34表達陰性(見圖 3)。圖3 第3代MSCs表面標志檢測a:CD105 對照；b：CD105 檢測；c：CD34 對照；d：CD34 檢測兩種方法分離的 MSCs 在細胞形態(tài)、細胞表面標志等方面無明顯差異；與Percoll(1.073g/ml)密度梯度離心法相比，F(xiàn)icoll(1.073g/ml)密度梯度離心法分離的有核細胞死亡率較少、原代培養(yǎng) 5d 貼壁生長的細胞克隆數(shù)較多、原代細胞生長至 80-100%所需時間較短(見表 3。)a b1.26％ 3.68％1.41％96.0％c d
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R329.2

【參考文獻】

相關期刊論文 前6條

1 賀偉峰,吳軍,易紹萱,羅高興,陳希煒,鄭峻松,馬兵,雷曉;人CTLA4Ig和EGFP雙基因共表達逆轉錄病毒載體構建及鑒定[J];第三軍醫(yī)大學學報;2002年07期

2 吳金輝,張西正,郭勇,武繼民,李瑞欣;用于組織工程化培養(yǎng)生物反應器的研究進展[J];國外醫(yī)學.生物醫(yī)學工程分冊;2003年02期

3 劉曉丹,郭子寬,李秀森,張雙喜,毛寧;人骨髓間充質干細胞分離與培養(yǎng)方法的建立[J];軍事醫(yī)學科學院院刊;2000年04期

4 陽富春;骨組織工程研究進展[J];山東生物醫(yī)學工程;2002年03期

5 陳健琳,郭子寬,徐晨,李欲航,侯春梅,毛寧,陳虎;間充質干細胞分泌TGF-β1抑制異體T細胞反應性[J];中國實驗血液學雜志;2002年04期

6 李異凡 ,張陽德;生物工程前沿——組織工程學[J];中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志;2002年16期

本文編號：2671607