【摘要】：研究背景及研究目的: 嚴(yán)重創(chuàng)傷、感染、腫瘤切除、骨病等原因所致的骨缺損在臨床治療中非常常見(jiàn),嚴(yán)重的骨缺損用現(xiàn)有的方法(如自體骨移植、異體骨移植、人工假體等)難以獲得滿意的療效。而骨組織工程理論上可以完全再生原有組織,被認(rèn)為是修復(fù)骨缺損理想的方法,在將來(lái)的臨床中具有廣闊的應(yīng)用前景。骨組織工程是體外將種子細(xì)胞種植到可吸收生物支架上后移植到體內(nèi)修復(fù)骨缺損的方法,其中種子細(xì)胞是最重要的環(huán)節(jié)之一。 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow derived mesenchymal stem cell,MSCs)被認(rèn)為是骨組織工程最佳的種子細(xì)胞。因?yàn)檫@種細(xì)胞不僅在體外增殖能力比成骨細(xì)胞強(qiáng)得多;而且具有多向分化潛能,在體內(nèi)外成骨誘導(dǎo)環(huán)境下可分化為骨組織;另外,這種細(xì)胞也較容易分離和培養(yǎng)。雖然目前還沒(méi)有找到MSCs特異的表面標(biāo)志,但普遍認(rèn)為MSCs形態(tài)呈梭形、貼壁生長(zhǎng)、類(lèi)似纖維細(xì)胞但與其功能完全不同;在第一、二代分別約95%、98%細(xì)胞的表型一致,為:SH2、SH3、CD29、CD90、CD106等陽(yáng)性,CD34、CD45、CD14陰性;強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)Stro-1,95%以上CD105表達(dá)陽(yáng)性。應(yīng)用MSCs作為骨組織工程種子細(xì)胞的研究很多,在自體移植修復(fù)骨缺損動(dòng)物模型和異基因移植修復(fù)免疫缺陷動(dòng)物骨缺損模型實(shí)驗(yàn)中取得了良好的效果。但MSCs在骨髓中含量很少,并隨著年齡的增長(zhǎng)減少;現(xiàn)有方法體外迅速擴(kuò)增困難。因此,自體MSCs的應(yīng)用會(huì)受來(lái)源和數(shù)量限制,難以滿足臨床治療的需要。 異基因MSCs來(lái)源及數(shù)量不受限制,可能作為骨組織工程種子細(xì)胞的另一個(gè)來(lái)源。然而,如果受體不進(jìn)行免疫抑制治療,異基因組織、細(xì)胞的移植必然會(huì)導(dǎo)致免疫排斥反應(yīng)。這是由供體與宿主DNA多態(tài)性位點(diǎn)上不同的等位基因所編碼的組織相容性抗原所決定的。另一方面,MSCs雖然表達(dá)MHCⅠ類(lèi)分子和粘附分子ICAM、VCAM、LFA-3;但其只表達(dá)極少量的MHCⅡ類(lèi)分子,不表達(dá)B7-1、B7-2和CD40、CD40L。這種特性決定了MSCs較低的免疫原性,可能有利于它的存活。研究表明:小劑量 國(guó)家自然科學(xué)青年基金資助項(xiàng)目(NO.30300090) 國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題基金資助項(xiàng)目 WP=13 MSCs可以刺激T淋巴細(xì)胞增生;大劑量MSCs則抑制ConA刺激的T淋巴細(xì)胞增生以及異基因混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)。未分化的MSCs在移植入人和動(dòng)物體內(nèi)都顯示出了較好的耐受;但其分化后代則被緩慢排斥。有人將轉(zhuǎn)染了BMP2的異基因MSCs作為種子細(xì)胞,在修復(fù)小鼠股骨骨缺損動(dòng)物模型中,短期應(yīng)用免疫抑制劑(FK506)的條件下獲得了與自體移植相當(dāng)?shù)某晒切Ч?異基因MSCs作為骨組織工程種子細(xì)胞,必須首先減輕免疫排斥反應(yīng)。免疫排斥是異基因器官和組織移植最大的障礙和最難解決的問(wèn)題,目前還沒(méi)有任何方法可以誘導(dǎo)特異的、完全的、終身的免疫耐受。在免疫耐受研究中,對(duì)CTLA4的研究取得了顯著的進(jìn)展和顯示了廣闊的前景。CTLA4(Cytotoxic Lymphocyte Antigen 4,CTLA4)是在CTL細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的第四種特異性抗原基因編碼的糖蛋白,它主要表達(dá)在活化的T 細(xì)胞上�？筛�(jìng)爭(zhēng)性抑制APC 膜上的B7分子與T細(xì)胞膜上的CD28結(jié)合,從而阻斷T 細(xì)胞的完全活化。CTLA4Ig是由CTLA4胞外區(qū)與IgG Fc 段融合而成,具有與CTLA4幾乎相同的生物學(xué)功能。大量實(shí)驗(yàn)證實(shí):CTLA4Ig具有誘導(dǎo)特異性免疫耐受的功能,雖然并不是完全的免疫耐受。因此,我們?cè)O(shè)想用CTLA4Ig基因轉(zhuǎn)染MSCs,通過(guò)細(xì)胞表達(dá)CTLA4Ig阻斷T細(xì)胞完全活化所需的輔助信號(hào)途徑,減輕免疫排斥反應(yīng),促進(jìn)基因修飾MSCs(MSCs-C)及其分化后代在宿主體內(nèi)的存活。 另一方面,MSCs-C要作為種子細(xì)胞,必須在體外具有旺盛的增殖能力和保持分化潛能。由于基因修飾后篩選穩(wěn)定整合的克隆需要多次傳代;而MSCs在體外只有20-30PD的生命期和在傳代中分化潛能逐漸減弱可能滿足不了需要。因此,要對(duì)MSCs進(jìn)行基因修飾并篩選克隆,可能首先應(yīng)當(dāng)延長(zhǎng)其體外培養(yǎng)生命期并保持分化潛能。人們對(duì)端粒酶的研究使這一設(shè)想成為可能。研究表明:端粒酶催化亞單位(hTERT)的活性與端粒的長(zhǎng)度呈正相關(guān),并在細(xì)胞永生化和分化中起重要作用;而且,異位表達(dá)hTERT在很多細(xì)胞中都可以延長(zhǎng)細(xì)胞壽命。Simonsen JL等將hTERT轉(zhuǎn)入hMSCs篩選到的hMSCs-T細(xì)胞克隆在體外培養(yǎng)200PD以上,細(xì)胞未發(fā)現(xiàn)明顯的衰老現(xiàn)象、保持了多向分化潛能并沒(méi)有致瘤傾向。這說(shuō)明用hTERT轉(zhuǎn)染修飾hMSCs可以達(dá)到延長(zhǎng)hMSCs生命周期、保持多向分化潛能的結(jié)果。 基于上述認(rèn)識(shí),本課題擬應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒將hCTLA4Ig基因?qū)肴斯撬栝g充質(zhì)干細(xì)胞,并篩選獲得MSCs-C細(xì)胞克隆或細(xì)胞群;研究基因修飾MSCs成骨分化潛能和減輕免疫排斥反應(yīng)情況,觀察其作為異基因種子細(xì)胞體內(nèi)成骨能力。從理論上講,這種細(xì)胞既可能保持成骨分化潛能;又可能通過(guò)表達(dá)CTLA4Ig控制免疫排斥反應(yīng)。這種特性更有利于MSCs-C的定植,可能對(duì)免疫排斥反應(yīng)不強(qiáng)的異基因MSCs移植是足夠 WP=14 的。從而使異基因MSCs-C作為骨組織工程的種子細(xì)胞成為可能,為解決骨組織工程種子細(xì)胞來(lái)源提供一種新的方法,拓寬骨組織工程的應(yīng)用范圍。另外,我們還擬構(gòu)建hTERT-真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染MSCs以延長(zhǎng)其生命期,為將來(lái)獲得雙基因修飾骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞克隆:MSCs-T-C細(xì)胞克隆奠定基礎(chǔ),爭(zhēng)取建立一種骨組織工程標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞系。 實(shí)驗(yàn)方法 1、應(yīng)用XhoI、StuI酶切鑒定pLXSN-CTLA4Ig-IRES2-EGFP重組質(zhì)粒;Nucleofecto
【圖文】：

的抗 CTLA4 抗體至終濃度 5μg胞懸浮于含 1%多聚甲醛的 PBA抗體作為對(duì)照。結(jié) 果IRES2-EGFP 重組質(zhì)粒酶切鑒定S2-EGFP (PLCIE)重組載體經(jīng) X儀上觀察可見(jiàn)一條 3.6kb 的目的kb 單一片斷(見(jiàn)圖 1)。與預(yù)期的結(jié)1 2 3 4

代細(xì)胞 FACS 檢測(cè)結(jié)果顯示：分離培養(yǎng)的細(xì)胞 94.59%CD105 表達(dá)陽(yáng)性，，97.58%CD34表達(dá)陰性(見(jiàn)圖 3)。圖3 第3代MSCs表面標(biāo)志檢測(cè)a:CD105 對(duì)照；b：CD105 檢測(cè)；c：CD34 對(duì)照；d：CD34 檢測(cè)兩種方法分離的 MSCs 在細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞表面標(biāo)志等方面無(wú)明顯差異；與Percoll(1.073g/ml)密度梯度離心法相比，F(xiàn)icoll(1.073g/ml)密度梯度離心法分離的有核細(xì)胞死亡率較少、原代培養(yǎng) 5d 貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞克隆數(shù)較多、原代細(xì)胞生長(zhǎng)至 80-100%所需時(shí)間較短(見(jiàn)表 3。)a b1.26％ 3.68％1.41％96.0％c d
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2671607