【摘要】：朊病毒病(prion diseases)也稱為可傳播性海綿狀腦病(transmissible spongiform encephalopathies, TSEs),是一類可感染包括人類在內(nèi)的多種哺乳動物的罕見致死性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。人類朊病毒病包括克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)、GSS綜合癥(Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome, GSS)、Kuru病和致死性家族性失眠癥(fatal familial insomnia, FFI)。動物朊病毒病包括羊瘙瘁病(scrapie)、牛海綿狀腦病(bovine spongiform encephalopathy, BSE)和鹿的慢性消耗性疾病(chronic wasting disease, CWD)等。所有類型的朊病毒病具有相似的神經(jīng)病理學(xué)改變：神經(jīng)元丟失、海綿狀空泡形成、星型膠質(zhì)細胞增生。根據(jù)唯蛋白假說(protein-only hypothesis),具有感染性和復(fù)制能力的錯誤折疊蛋白PrpSc是朊病毒病的病原。Borchelt在PrpSc動力學(xué)研究中發(fā)現(xiàn),PrPsc的生成是較為緩慢的過程,其半數(shù)生成時間(t1/2)為15h。而PrPsc一旦生成,細胞幾乎無法降解。因此,我們推測細胞的蛋白降解系統(tǒng)可能在PrPSc的沉積及朊病毒病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。 細胞自噬(autophagy)是廣泛存在于真核細胞內(nèi)的一種溶酶體依賴的蛋白降解途徑。細胞中的大分子(如：蛋白質(zhì)、糖類、核酸等)、細胞內(nèi)源性物質(zhì)(如：細胞器)和外源性物質(zhì)(如：細菌、病毒等)均可通過自噬途徑降解。自噬由細胞漿中形成的類似脂質(zhì)體的膜結(jié)構(gòu)起始,不斷擴張,包裹被降解底物,融合形成雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體,之后自噬體與溶酶體融合,最終底物在溶酶體內(nèi)被降解。自噬在病毒感染和神經(jīng)退行性疾病中可能發(fā)揮著“雙刃劍”的作用。一方面自噬可以降解病毒顆粒和錯誤折疊蛋白,發(fā)揮神經(jīng)保護的作用；另一方面,過度激活的自噬可以引發(fā)自噬相關(guān)細胞程序性死亡(autophagy-associated cell death)。 為了探討自噬與PrPSc沉積的關(guān)系,揭示其在朊病毒病發(fā)生、發(fā)展中可能的作用,我們設(shè)計了一系列細胞實驗和動物實驗,以期在體外模型和體內(nèi)模型兩個層面闡明自噬系統(tǒng)在朊病毒病中的變化規(guī)律及該變化產(chǎn)生的機制,為深入研發(fā)以自噬為基礎(chǔ)的抗朊病毒治療策略提供新的思路。 本研究的主要結(jié)果如下： 1.以穩(wěn)定感染羊騷癢因子Chandler株的小鼠腦細胞系SMB-S15為研究對象,經(jīng)戊聚糖硫酸酯治療后康復(fù)的細胞系SMB-PS為對照,檢測自噬小體和自噬流的差異。結(jié)果顯示,SMB-S15細胞中LC3-Ⅱ表達上調(diào),而p62蛋白含量下降。轉(zhuǎn)染自噬流報告質(zhì)粒tfLC3的SMB-S15細胞中自噬小體和自噬溶酶體的數(shù)量明顯增加。表明朊病毒感染細胞中,自噬小體數(shù)量增多,自噬流活化。 2.以SMB-S15和SMB-PS細胞分別為研究對象和對照,檢測自噬調(diào)控相關(guān)信號通路的變化。結(jié)果顯示,朊病毒感染可明顯抑制mTOR信號通路,而對Beclinl信號通路影響不明顯。此外,在SMB-S15細胞中,mTOR蛋白的E3泛素連接酶FBXW7表達量和其與mTOR的共定位均顯著增加。 3.以SMB-S15和SMB-PS細胞分別為研究對象和對照,利用siRNA技術(shù)和多種自噬阻斷劑抑制自噬流,研究細胞內(nèi)源性自噬對朊病毒Prpsc沉積的影響。結(jié)果表明,阻斷自噬可顯著增加SMB-S15細胞中Prpsc的含量。 4.以SMB-S15和SMB-PS細胞分別為研究對象和對照,利用shRNA技術(shù),檢測敲降FBXW7對自噬系統(tǒng)和朊病毒Prpsc含量的影響。結(jié)果表明,敲降FBXW7可以顯著抑制自噬并增加SMB-S15細胞中Prpsc的含量。 5.以羊騷癢因子263K感染倉鼠的腦組織標(biāo)本和人CJD、FFI患者腦組織標(biāo)本為研究對象,檢測朊病毒感染對體內(nèi)自噬調(diào)節(jié)信號通路和自噬流的影響。結(jié)果顯示,朊病毒感染可顯著抑制mTOR信號通路并活化自噬系統(tǒng)。 6.以SMB-S15細胞和263K感染倉鼠的腦組織切片為研究對象,通過免疫熒光技術(shù),檢測朊病毒PrPSc和自噬小體的共定位情況。在Bafilomycin A1處理SMB-S15細胞后可明顯觀察到Prpsc和自噬小體的共定位現(xiàn)象,但在263K感染的倉鼠腦組織切片中未觀察到此現(xiàn)象。 7.以SMB-S15細胞為研究對象,通過阻斷自噬流,研究內(nèi)源性自噬對細胞活力的影響。以263K感染的倉鼠腦組織切片為研究對象,通過分區(qū)分析和尼氏染色研究自噬與神經(jīng)元丟失的相關(guān)性。結(jié)果表明,阻斷自噬可增加SMB-S15細胞的活力。在倉鼠模型中,自噬小體的增加和神經(jīng)元丟失在空間上高度相關(guān)。 綜上,我們以SMB細胞和倉鼠、人腦組織標(biāo)本為研究對象,在體外、體內(nèi)兩個層面證明了朊病毒感染可活化自噬。進一步研究表明FBXW7上調(diào)引起的mTOR降解是引起自噬活化的主要原因。內(nèi)源性自噬的活化促進PrPSc的降解,發(fā)揮抗病毒天然免疫的作用。同時活化的內(nèi)源性自噬可能參與了朊病毒感染引起的神經(jīng)元死亡。
【圖文】：

中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 博士學(xué)位酸的火活劑，而對蛋白變性劑和裂解劑敏感，故而被認為有自我復(fù)制能力的蛋白。David Borchelt在PrpS。動力學(xué)研究牛.成是較為緩慢的過程，其半數(shù)成時間（ti/2)為15 ho蛋白的存在都是合成與降解達成穩(wěn)態(tài)的結(jié)果，因此我們推降解速度較合成速度更為緩慢時，才能形成PrpSe的堆積。蛋白酶K抗性也提示，，Prpse —但在細胞內(nèi)生成就很難被清除。

細胞中的生物大分子（如：蛋白質(zhì)、糖類、核酸等）、細胞內(nèi)源性物質(zhì)（如：細胞器）和外源性物質(zhì)（如：細菌、病毒等）均可通過自嘴途徑降解。自嚼由胞i}中形成的類似脂質(zhì)體的膜結(jié)構(gòu)起始，不斷擴張，包裹被降解物，融合形成雙層膜結(jié)構(gòu)的自唾體，隨后與溶酶體融合，最終降解其中底物[14]。自丨j基因（autophagy-related gene, ATG)的克隆始于酵母。第一個酵母自嘴基因十1997年被H本科學(xué)家Yoshinori Ohsumi研究組克隆，命名為Atgl[15]o第一個哺乳動物自嚼基因于1998年被美國科學(xué)家Beth Levine研究組克隆，命名為Beclinl[16]。截止到2010年已經(jīng)克隆了 34個Atg基因[17]。Atg基因所編碼的蛋白貫穿于自嚼的整個過程，按其行使的功能可以分為四大類：自魄膜起始、自_膜延伸、自嘴體運動、自嚼體-溶酶體融合等（如圖2所示）。這四類Atg分子在自噻途徑的不同階段發(fā)揮作用，進而調(diào)節(jié)自唾通路。Vesicle breakdown
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R373

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本文編號：2671382