發(fā)布時(shí)間：2020-05-19 19:42

【摘要】：朊病毒病(prion diseases)也稱為可傳播性海綿狀腦病(transmissible spongiform encephalopathies, TSEs),是一類可感染包括人類在內(nèi)的多種哺乳動(dòng)物的罕見致死性神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。人類朊病毒病包括克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)、GSS綜合癥(Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome, GSS)、Kuru病和致死性家族性失眠癥(fatal familial insomnia, FFI)。動(dòng)物朊病毒病包括羊瘙瘁病(scrapie)、牛海綿狀腦病(bovine spongiform encephalopathy, BSE)和鹿的慢性消耗性疾病(chronic wasting disease, CWD)等。所有類型的朊病毒病具有相似的神經(jīng)病理學(xué)改變：神經(jīng)元丟失、海綿狀空泡形成、星型膠質(zhì)細(xì)胞增生。根據(jù)唯蛋白假說(shuō)(protein-only hypothesis),具有感染性和復(fù)制能力的錯(cuò)誤折疊蛋白PrpSc是朊病毒病的病原。Borchelt在PrpSc動(dòng)力學(xué)研究中發(fā)現(xiàn),PrPsc的生成是較為緩慢的過(guò)程,其半數(shù)生成時(shí)間(t1/2)為15h。而PrPsc一旦生成,細(xì)胞幾乎無(wú)法降解。因此,我們推測(cè)細(xì)胞的蛋白降解系統(tǒng)可能在PrPSc的沉積及朊病毒病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。 細(xì)胞自噬(autophagy)是廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)的一種溶酶體依賴的蛋白降解途徑。細(xì)胞中的大分子(如：蛋白質(zhì)、糖類、核酸等)、細(xì)胞內(nèi)源性物質(zhì)(如：細(xì)胞器)和外源性物質(zhì)(如：細(xì)菌、病毒等)均可通過(guò)自噬途徑降解。自噬由細(xì)胞漿中形成的類似脂質(zhì)體的膜結(jié)構(gòu)起始,不斷擴(kuò)張,包裹被降解底物,融合形成雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體,之后自噬體與溶酶體融合,最終底物在溶酶體內(nèi)被降解。自噬在病毒感染和神經(jīng)退行性疾病中可能發(fā)揮著“雙刃劍”的作用。一方面自噬可以降解病毒顆粒和錯(cuò)誤折疊蛋白,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的作用；另一方面,過(guò)度激活的自噬可以引發(fā)自噬相關(guān)細(xì)胞程序性死亡(autophagy-associated cell death)。 為了探討自噬與PrPSc沉積的關(guān)系,揭示其在朊病毒病發(fā)生、發(fā)展中可能的作用,我們?cè)O(shè)計(jì)了一系列細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn),以期在體外模型和體內(nèi)模型兩個(gè)層面闡明自噬系統(tǒng)在朊病毒病中的變化規(guī)律及該變化產(chǎn)生的機(jī)制,為深入研發(fā)以自噬為基礎(chǔ)的抗朊病毒治療策略提供新的思路。 本研究的主要結(jié)果如下： 1.以穩(wěn)定感染羊騷癢因子Chandler株的小鼠腦細(xì)胞系SMB-S15為研究對(duì)象,經(jīng)戊聚糖硫酸酯治療后康復(fù)的細(xì)胞系SMB-PS為對(duì)照,檢測(cè)自噬小體和自噬流的差異。結(jié)果顯示,SMB-S15細(xì)胞中LC3-Ⅱ表達(dá)上調(diào),而p62蛋白含量下降。轉(zhuǎn)染自噬流報(bào)告質(zhì)粒tfLC3的SMB-S15細(xì)胞中自噬小體和自噬溶酶體的數(shù)量明顯增加。表明朊病毒感染細(xì)胞中,自噬小體數(shù)量增多,自噬流活化。 2.以SMB-S15和SMB-PS細(xì)胞分別為研究對(duì)象和對(duì)照,檢測(cè)自噬調(diào)控相關(guān)信號(hào)通路的變化。結(jié)果顯示,朊病毒感染可明顯抑制mTOR信號(hào)通路,而對(duì)Beclinl信號(hào)通路影響不明顯。此外,在SMB-S15細(xì)胞中,mTOR蛋白的E3泛素連接酶FBXW7表達(dá)量和其與mTOR的共定位均顯著增加。 3.以SMB-S15和SMB-PS細(xì)胞分別為研究對(duì)象和對(duì)照,利用siRNA技術(shù)和多種自噬阻斷劑抑制自噬流,研究細(xì)胞內(nèi)源性自噬對(duì)朊病毒Prpsc沉積的影響。結(jié)果表明,阻斷自噬可顯著增加SMB-S15細(xì)胞中Prpsc的含量。 4.以SMB-S15和SMB-PS細(xì)胞分別為研究對(duì)象和對(duì)照,利用shRNA技術(shù),檢測(cè)敲降FBXW7對(duì)自噬系統(tǒng)和朊病毒Prpsc含量的影響。結(jié)果表明,敲降FBXW7可以顯著抑制自噬并增加SMB-S15細(xì)胞中Prpsc的含量。 5.以羊騷癢因子263K感染倉(cāng)鼠的腦組織標(biāo)本和人CJD、FFI患者腦組織標(biāo)本為研究對(duì)象,檢測(cè)朊病毒感染對(duì)體內(nèi)自噬調(diào)節(jié)信號(hào)通路和自噬流的影響。結(jié)果顯示,朊病毒感染可顯著抑制mTOR信號(hào)通路并活化自噬系統(tǒng)。 6.以SMB-S15細(xì)胞和263K感染倉(cāng)鼠的腦組織切片為研究對(duì)象,通過(guò)免疫熒光技術(shù),檢測(cè)朊病毒PrPSc和自噬小體的共定位情況。在Bafilomycin A1處理SMB-S15細(xì)胞后可明顯觀察到Prpsc和自噬小體的共定位現(xiàn)象,但在263K感染的倉(cāng)鼠腦組織切片中未觀察到此現(xiàn)象。 7.以SMB-S15細(xì)胞為研究對(duì)象,通過(guò)阻斷自噬流,研究?jī)?nèi)源性自噬對(duì)細(xì)胞活力的影響。以263K感染的倉(cāng)鼠腦組織切片為研究對(duì)象,通過(guò)分區(qū)分析和尼氏染色研究自噬與神經(jīng)元丟失的相關(guān)性。結(jié)果表明,阻斷自噬可增加SMB-S15細(xì)胞的活力。在倉(cāng)鼠模型中,自噬小體的增加和神經(jīng)元丟失在空間上高度相關(guān)。 綜上,我們以SMB細(xì)胞和倉(cāng)鼠、人腦組織標(biāo)本為研究對(duì)象,在體外、體內(nèi)兩個(gè)層面證明了朊病毒感染可活化自噬。進(jìn)一步研究表明FBXW7上調(diào)引起的mTOR降解是引起自噬活化的主要原因。內(nèi)源性自噬的活化促進(jìn)PrPSc的降解,發(fā)揮抗病毒天然免疫的作用。同時(shí)活化的內(nèi)源性自噬可能參與了朊病毒感染引起的神經(jīng)元死亡。
【圖文】：

中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 博士學(xué)位酸的火活劑，而對(duì)蛋白變性劑和裂解劑敏感，故而被認(rèn)為有自我復(fù)制能力的蛋白。David Borchelt在PrpS。動(dòng)力學(xué)研究牛.成是較為緩慢的過(guò)程，其半數(shù)成時(shí)間（ti/2)為15 ho蛋白的存在都是合成與降解達(dá)成穩(wěn)態(tài)的結(jié)果，因此我們推降解速度較合成速度更為緩慢時(shí)，才能形成PrpSe的堆積。蛋白酶K抗性也提示，，Prpse —但在細(xì)胞內(nèi)生成就很難被清除。

細(xì)胞中的生物大分子（如：蛋白質(zhì)、糖類、核酸等）、細(xì)胞內(nèi)源性物質(zhì)（如：細(xì)胞器）和外源性物質(zhì)（如：細(xì)菌、病毒等）均可通過(guò)自嘴途徑降解。自嚼由胞i}中形成的類似脂質(zhì)體的膜結(jié)構(gòu)起始，不斷擴(kuò)張，包裹被降解物，融合形成雙層膜結(jié)構(gòu)的自唾體，隨后與溶酶體融合，最終降解其中底物[14]。自丨j基因（autophagy-related gene, ATG)的克隆始于酵母。第一個(gè)酵母自嘴基因十1997年被H本科學(xué)家Yoshinori Ohsumi研究組克隆，命名為Atgl[15]o第一個(gè)哺乳動(dòng)物自嚼基因于1998年被美國(guó)科學(xué)家Beth Levine研究組克隆，命名為Beclinl[16]。截止到2010年已經(jīng)克隆了 34個(gè)Atg基因[17]。Atg基因所編碼的蛋白貫穿于自嚼的整個(gè)過(guò)程，按其行使的功能可以分為四大類：自魄膜起始、自_膜延伸、自嘴體運(yùn)動(dòng)、自嚼體-溶酶體融合等（如圖2所示）。這四類Atg分子在自噻途徑的不同階段發(fā)揮作用，進(jìn)而調(diào)節(jié)自唾通路。Vesicle breakdown
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R373

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