【摘要】： 化學(xué)致癌物可以引起DNA損傷或非DNA損傷效應(yīng)(外遺傳效應(yīng))，前者如果沒有被正確修復(fù)，則有可能通過跨損傷合成途徑形成定標(biāo)突變。非定標(biāo)突變是指發(fā)生在非損傷DNA部位的突變，有可能被DNA損傷或非DNA損傷效應(yīng)所誘發(fā)。 當(dāng)暴露于環(huán)境因子時(shí)(比如紫外線輻射)，大腸桿菌會激活SOS反應(yīng)，，從而產(chǎn)生損傷耐受，但其后果之一是引起非定標(biāo)突變，而DNA聚合酶Ⅳ、Ⅴ均參與了SOS誘發(fā)的非定標(biāo)突變。DNA聚合酶Ⅳ主要引起非定標(biāo)-1移碼突變，DNA聚合酶Ⅴ則需要RecA*蛋白與SSB的協(xié)同，引起的非定標(biāo)突變的突變譜以顛換為主(占53％)。單核苷酸置換與一個(gè)堿基缺失的比例為1:2。但是，真核生物中非定標(biāo)突變的發(fā)生機(jī)制還不清楚。 我們實(shí)驗(yàn)室近年的工作對哺乳細(xì)胞非定標(biāo)突變機(jī)制的研究初步表明，細(xì)胞在受低劑量MNNG攻擊后的早期，首先發(fā)生外遺傳的改變，包括45KD與62KD蛋白酪氨酸磷酸化水平的升高、JNK／SAPK通路的激活、cAMP-PKA-CREB通路的激活以及NF-κB的激活。同時(shí)在產(chǎn)生非定標(biāo)突變的細(xì)胞中檢測到基因表達(dá)的改變，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞受MNNG攻擊后DNA復(fù)制保真度下降、DNA聚合酶酶譜發(fā)生改變。因此，我們推測，哺乳細(xì)胞中低保真度的跨損傷DNA聚合酶可能參與了MNNG誘導(dǎo)的哺乳 細(xì)胞非定標(biāo)突變。初步認(rèn)為，MNNG誘發(fā)非定標(biāo)突變的形成是繼有關(guān)細(xì) 胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活后，導(dǎo)致相關(guān)基因表達(dá)的改變，并引起DNA聚合酶 酶譜表達(dá)的改變，最終使DNA復(fù)制保真度下降，從而使突變發(fā)生在未損 傷的DNA模板上。但是，哺乳細(xì)胞中是哪種跨損傷DNA聚合酶參與了 非定標(biāo)突變還不是很清楚。本實(shí)驗(yàn)對人DNA聚合酶＜催化亞基的編碼基 因REV3在非定標(biāo)突變形成中的作用及其轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了研 究。 結(jié)果表明，低劑量MN’NG攻擊人羊膜上皮培養(yǎng)細(xì)胞（FL）會引起REV3 基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)上調(diào)，并具有時(shí)相性變化，其表達(dá)水平分別在MNNG 處理后1二小時(shí)與24小時(shí)較對照提高1．刀倍與1石5倍O＜0刀勻。這種表 達(dá)變化與我們實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)的MN’NG誘發(fā)的非定標(biāo)突變形成的時(shí)相是基本 一致的。進(jìn)一步的非定標(biāo)突變分析顯示，REV3基因功能被反義阻斷的細(xì) 胞具有極顯著的抗非定標(biāo)突變的作用。在REV3基因被反義阻斷的 FL－REV3”細(xì)胞中，pG誘發(fā)的非定標(biāo)突變頻率極顯著地從27．4 X10”4 下降到4刀X10－4�。�0刀1人恢復(fù)到自發(fā)突變的水平。WesteX印跡證實(shí) 了FLREV3細(xì)胞中REV3基因功能得到了有效的反義阻斷。從而首次證 實(shí)，DNA聚合酶二參與了哺乳細(xì)胞非定標(biāo)突變的形成。 如前所述，低劑量MNNG會引起哺乳細(xì)胞早期的某些外遺傳改變， 激活轉(zhuǎn)錄因子CREB、AP－l以及NF－h(huán)。本實(shí)驗(yàn)中的生物信息學(xué)分析顯 示，人REV3基因啟動子區(qū)域存在上述轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。因此，我們 推測，MN’NG引起的有些轉(zhuǎn)錄因子的激活導(dǎo)致REV3基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá) 上調(diào)。而REV3基因的激活，導(dǎo)致人DNA聚合酶二參與非定標(biāo)突變的形 成。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合計(jì)算機(jī)染色體步移技術(shù)、報(bào)告基因以及瞬時(shí)轉(zhuǎn)染分析， 首次克隆了人REV3基因啟動子，并研究了其對MN’NG的反應(yīng)。結(jié)果表 明，在細(xì)胞受到MNNO攻擊后24小時(shí)，與基礎(chǔ)表達(dá)相比，REV3基因的 3 啟動子強(qiáng)度極顯著地增強(qiáng)了。進(jìn)一步的REV3基因啟動子缺失體分析結(jié)果 表明，REV3基因啟動子對MN’NG的反應(yīng)元件區(qū)域存在于位于REV3基因 上游－404～102核昔酸之間upGL3衛(wèi)582重組子的20if位與2314位 Sma酶切位點(diǎn)之（e），而僅含有單獨(dú)的CREB元件還不足以激活REV3 基因的表達(dá)，需要數(shù)個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的共同調(diào)控。 綜合上述研究表明，在MNNG誘發(fā)的哺乳細(xì)胞非定標(biāo)突變形成過程 中，早期的外遺傳改變可以最終激活人DNA聚合酶＜的催化亞基編碼基 因REV3的表達(dá)，從而募集低保真度的DNA聚合酶二參與形成非定標(biāo)突 變。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R346

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2671808