【摘要】：研究背景及目的： 臨床上導致周圍神經(jīng)缺損的原因很多,如腫瘤切除、創(chuàng)傷等均可造成神經(jīng)缺損。臨床上治療周圍神經(jīng)離斷除及時的神經(jīng)對位縫合外,一般常用自體神經(jīng)移植來治療,但是存在造成供區(qū)神經(jīng)功能喪失、遺留手術(shù)疤痕及供體有限、供區(qū)的附加切口、移植神經(jīng)支配區(qū)的功能障礙等問題,且并不能保證達到確實的修復效果。近年來,周圍神經(jīng)組織工程技術(shù)的興起,為神經(jīng)缺損的修復提供了新的方法和手段。 從生物學觀點看,周圍神經(jīng)再生是一個相當復雜的過程,受到多種因素的影響。周圍神經(jīng)再生過程中,再生軸突的生長、定向和成熟受到周圍神經(jīng)再生微環(huán)境中各種因素的影響,其中有細胞、細胞外基質(zhì)和彌散因子等,在再生早期尚有變性的軸突和髓鞘碎屑,其中細胞成份有SC、成纖維細胞、肥大細胞和巨噬細胞等。 周圍神經(jīng)損傷后,其遠側(cè)端由于失去了與神經(jīng)元胞體的聯(lián)系,遠側(cè)端神經(jīng)纖維的全長發(fā)生華勒氏變性,在光鏡下可見軸突腫脹、外形不規(guī)則、斷裂和溶解等變化。近側(cè)端由于與神經(jīng)元胞體的連續(xù)性存在,根據(jù)不同程度的創(chuàng)傷而出現(xiàn)一個或幾個郎飛結(jié)的變性改變。周圍神經(jīng)再生過程中,近側(cè)端軸突的再生和向遠側(cè)端的長入,是神經(jīng)再生的必要條件,也是神經(jīng)再生的首要因素,而SC恰恰是周圍神經(jīng)再生微環(huán)中的最重要因素。 SC是PNS特有的膠質(zhì)細胞,具有增生、遷移和分泌多種活性物質(zhì)等一系列特有的生物學特性,是周圍神經(jīng)纖維唯一的支持細胞。SC具有顯著的功能多樣性,在周圍神經(jīng)再生微環(huán)境中,Sc通過與軸突之間的聯(lián)系來調(diào)節(jié)髓鞘化、髓鞘形成,且SC參與周圍神經(jīng)干細胞外基質(zhì)的形成.周圍神經(jīng)損傷后,SC發(fā)生反應性增殖,與血源性巨噬細胞一起清除潰變產(chǎn)物,產(chǎn)生及分泌某些物質(zhì)影響神經(jīng)的再生,SC在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中促進軸突再生具有重要作用。因此,國內(nèi)外的學者越來越重視對SC與軸突再生關(guān)系的研究。 目前,大多數(shù)研究多關(guān)注于周圍神經(jīng)損傷后遠側(cè)端神經(jīng)再生微環(huán)境的變化。周圍神經(jīng)損傷后,其遠側(cè)端中斷了與神經(jīng)元胞體的聯(lián)系,遠側(cè)端神經(jīng)纖維的全長直至其終末都發(fā)生潰變,稱為華勒氏變性,包括軸突和髓鞘的變性.留下原先包繞著軸突的基底膜管,SC在基底膜管內(nèi)分裂、增殖,形成Bunger帶,同時伴有巨噬細胞的浸潤、神經(jīng)內(nèi)膜膠原產(chǎn)物的沉積等一系列變化。所有的這些變化都與SC有著廣泛的聯(lián)系。所以,SC是構(gòu)成周圍神經(jīng)再生微環(huán)境的主要成份,是促進再生軸突生長的關(guān)鍵因素,一旦在神經(jīng)再生微環(huán)境內(nèi)缺少SC,軸突或不能生長,或再生速度大大下降。因此,對周圍神經(jīng)再生微環(huán)境的研究多集中于SC,周圍神經(jīng)損傷后,SC的數(shù)量、形態(tài)學和生物學特性的變化直接影響神經(jīng)再生的微環(huán)境。李奕對成年大鼠周圍神經(jīng)損傷后遠側(cè)端SC的變化進行了體外研究,結(jié)果表明,周圍神經(jīng)損傷后,SC形態(tài)發(fā)生改變,1月最明顯；細胞活力和增殖能力也發(fā)生改變,1周活力和增殖能力最強,隨后逐漸變?nèi)�。目�?對于周圍神經(jīng)損傷后近側(cè)端變化的研究較少,特別是沒有關(guān)于周圍神經(jīng)損傷后近側(cè)端SC的數(shù)量、形態(tài)學和生物學特性變化的研究的報道。我們認為,在周圍神經(jīng)再生過程中,近側(cè)端軸突的再生和向遠側(cè)端的長入,是神經(jīng)再生的必要條件,也是神經(jīng)再生的首要因素,而SC恰恰是周圍神經(jīng)再生微環(huán)中的最重要因素。 雪旺細胞在周圍神經(jīng)組織工程修復中充當種子細胞,是構(gòu)建組織工程化神經(jīng)的關(guān)鍵。因此快速獲得組織工程化人工神經(jīng)所需要的SC非常重要。目前國內(nèi)外在此方面有較多的研究,但是SC是一種終末期細胞,直接取材行雪旺細胞培養(yǎng),細胞很難貼壁,擴增差,很難得到高純度及大量的SC,所以普遍存在著技術(shù)復雜、所需試劑昂貴、SC純度不高等不足,限制了人工神經(jīng)在臨床上的應用。國內(nèi)外許多學者研究將干細胞向類雪旺細胞誘導來解決此難題,但誘導率低、誘導條件撤離后再次向干細胞形態(tài)轉(zhuǎn)歸及致瘤性等缺點,仍限制了其進一步的應用。 在積極探索改進雪旺細胞的體外培養(yǎng)條件,尋找一種較好的獲取雪旺細胞的方法,以獲得足夠數(shù)量的較純凈的雪旺細胞的實踐中,人們發(fā)現(xiàn),神經(jīng)預變性不失為一種好的方法,而本實驗探索的新的體外預變性方法具有獨特的優(yōu)越性。神經(jīng)預變性的目的是創(chuàng)造一個有利于神經(jīng)再生的微環(huán)境,雪旺細胞的大量增殖是完成這個目的的必要條件。 目前研究表明SC在生長發(fā)育的不同階段及損傷修復過程中表達不同的標記,表明SC并不是一個功能結(jié)構(gòu)同質(zhì)體,在不同階段有不同的增值生長能力。神經(jīng)損傷的瓦勒變性過程中,SC發(fā)生去分化變化,表達神經(jīng)營養(yǎng)因子、細胞粘附分子及不成熟SC標記膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、p75NTR的上調(diào),而這些變化有利于細胞的增值及粘附,促進神經(jīng)的再生,可能有利于SC的體外貼壁培養(yǎng)、擴增,從而獲得大量的SC滿足人工神經(jīng)的需要。1999年Keilhoff等通過體內(nèi)預變性(瓦勒變性)一周后體外再培養(yǎng)獲得了大量的增殖能力強的SCs,證實通過預變性再行細胞培養(yǎng)可以獲得大量的增殖能力強的SC。2009年,Tomita等進行了體內(nèi)預變性的研究,他們通過觀察預變性后雪旺細胞的遷移情況來評價預變性效果,發(fā)現(xiàn)2周后雪旺細胞遷移最多。體內(nèi)預變性可以提供大量的增殖能力強的雪旺細胞,有令人興奮的臨床應用前景。但體內(nèi)預變性需要兩次手術(shù),花費的時間較長,延誤了治療時機,同時由于存在個體差異預變性達到所需效果的時間點難以控制,臨床應用受到一定的限制。因此我們的研究中將成年小鼠的坐骨神經(jīng)取出放在體外培養(yǎng)液中預先培養(yǎng)一段時間即體外預變性模擬體內(nèi)的發(fā)生情況,可以避免體內(nèi)方法的不足。2010年Armin kram等報道了體外預變性,他將坐骨神經(jīng)置于DMEM+10%FBS進行預變性,結(jié)果預變性一周后細胞培養(yǎng),獲得了大量高純度的SCs。 體內(nèi)預變性是一個復雜的過程,是多種細胞及因子參與的結(jié)果,因此體外預變性要達到體內(nèi)的效果必須模擬體內(nèi)環(huán)境。本實驗中,我們加入了雪旺細胞生長所需要的生長因子(forskolin、heregulin-β-1、堿性成纖維細胞生長因子)以期模擬體內(nèi)實驗的效果。 方法： 1.實驗動物：綠色熒光蛋白(GFP)轉(zhuǎn)基因小鼠。c57小鼠,雌雄不限。 2.體外預變性：小鼠頸椎脫臼處死,分離切取坐骨神經(jīng),放于含有DMEM. DMEM+10%FBS、SCCM培養(yǎng)液中培養(yǎng),1周后待檢。體內(nèi)預變性：小鼠10%戊巴比妥腹腔注射麻醉,暴露右側(cè)坐骨神經(jīng),在遠離脊神經(jīng)根部切斷坐骨神經(jīng),并使斷端游離。術(shù)后1、2、3周取材待檢。 3.細胞培養(yǎng)及冰凍切片制作：分別將不同培養(yǎng)液中培養(yǎng)的及新鮮的坐骨神經(jīng)組織漂洗,切碎,消化酶溶解,接種培養(yǎng),傳代。48小時后對SCCM組細胞進行純化并做冰凍切片。 4.組織和細胞免疫熒光檢測：取各組的冰凍切片及培養(yǎng)的原代細胞行兔抗S100β及p75NTR免疫熒光染色。激光共聚焦顯微鏡觀察組織切片中綠色熒光蛋白及S100p表達情況,普通熒光顯微鏡下觀察細胞染色情況,隨機選取5個視野計算細胞純度。 5.激光共聚焦下觀察拍照。 6.統(tǒng)計學處理：所有計數(shù)值以均數(shù)±標準差(x±s)表示,應用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。組間均數(shù)比較單因素方差分析(One-Way ANOVA),多重比較方差齊性下采用LSD方法,方差不齊時采用Dunnett T3方法。P0.05提示差異具有統(tǒng)計學意義。 結(jié)果： 1.GFP小鼠組中,體外預變性1周后坐骨神經(jīng)組織切片綠色熒光表達最強,p75熒光表達最強,說明體外預變性的最佳時間是一周； 2.GFP小鼠組中,SCCM組中1、2、3周綠色熒光表達和p75熒光表達最強。SCCM組與DMEM組和DMEM+10%FBS組及對照組雪旺細胞數(shù)、細胞純度和細胞密度均具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。 3.C57小鼠組中,對于SCCM培養(yǎng)液中預先培養(yǎng)的坐骨神經(jīng)獲取的細胞S100p蛋白的免疫熒光染色,發(fā)現(xiàn)幾乎所有的雙極或三極樣細胞均為陽性,隨機選取三個視野計算純度為98%。SCCM組與DMEM+10%FBS組和對照組比較,雪旺細胞數(shù)和細胞密度均具有統(tǒng)計學差異(P0.05)。各組原代細胞培養(yǎng)48小時后,雪旺細胞純度,DMEM+10%FBS、SCCM中分別為82.83±3.43%,89.67±3.14%。結(jié)論： 1.坐骨神經(jīng)體外預變性后再行細胞培養(yǎng)簡單,高效,是一種很好的體外培養(yǎng)成年小鼠雪旺細胞的方法。 2.預變性一周后雪旺細胞增值最好。 3.雪旺細胞在培養(yǎng)介質(zhì)DMEM、DMEM+10%FBS、SCCM及體內(nèi)對照組中純度對比,SCCM最優(yōu),DMEM+10%FBS優(yōu)于DMEM。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R329.2

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