【摘要】：胰島素樣生長因子-Ⅰ(Insulin-like growth factor-Ⅰ，IGF-Ⅰ)是一種作用 于多種組織和多種器官的多效性細(xì)胞營養(yǎng)因子，早在上個(gè)世紀(jì)中葉就已經(jīng)受到 人們的廣泛關(guān)注。中樞神經(jīng)系統(tǒng)由于其自身結(jié)構(gòu)的特殊性和復(fù)雜性極大地限制 了關(guān)于IGF-Ⅰ在該系統(tǒng)內(nèi)確切的生物學(xué)作用及其作用機(jī)制的研究。雖然人們圍 繞IGF-Ⅰ在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的生物學(xué)作用開展了大量的研究，但較多地采用了 體外分離不同類型的神經(jīng)細(xì)胞來研究IGF-Ⅰ的生物學(xué)作用。由于體外分離的細(xì) 胞是一種“病態(tài)”細(xì)胞，本身并不能完全代表它在體內(nèi)發(fā)揮作用時(shí)的真實(shí)情況。 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型以其能夠最大限度地模擬體內(nèi)某種基因發(fā)揮作用的真實(shí)環(huán)境從 而更加容易和準(zhǔn)確地探討該基因的生物學(xué)功能及表達(dá)調(diào)控機(jī)制而倍受青睞。 為了能夠方便、準(zhǔn)確而且真實(shí)地研究IGF-Ⅰ在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)生發(fā)育過 程中以及在各種應(yīng)激、脅迫或疾病條件下所發(fā)揮的神經(jīng)生物學(xué)作用及其作用機(jī) 制，特別需要建立一個(gè)能夠在不同的時(shí)相下在中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異性即時(shí)性表達(dá) 人IGF-Ⅰ的轉(zhuǎn)基因小鼠模型，為此開展了下面的研究。 首先，需要得到一個(gè)能夠指導(dǎo)外源蛋白在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中特異性表達(dá)的啟 動(dòng)子。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞原纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)為神 經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的主要骨架蛋白，該蛋白的表達(dá)主要局限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的星形膠 質(zhì)細(xì)胞中，，傳統(tǒng)上被認(rèn)為是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物。由于當(dāng)時(shí)GFAP基 因的調(diào)控序列尚屬未知，因此需要克隆小鼠GFAP基因的5’端調(diào)控區(qū)。本研究 采用PCR方法篩選129sv小鼠的基因組文庫，經(jīng)過兩輪的PCR篩選和一次噬菌 斑原位雜交，成功地從文庫中分離到載有GFAP基因的陽性噬菌體，最終獲得 了包括GFAP基因1． 8Kb的5’端調(diào)控區(qū)和部分編碼區(qū)在內(nèi)2353bp的核苷酸序列， 博士學(xué)位論文 中文摘要 該段序列已經(jīng)被GeneBank收錄(收錄號(hào):AY279974)。經(jīng)與GeneBank中己有 的GFAP基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)不同種屬小鼠的GFAP基因存在不同的翻譯 起始位點(diǎn)和N端氨基酸序列。 我們利用得到的GFAP基因1 .SKb的5’端調(diào)控區(qū)構(gòu)建了中樞神經(jīng)系統(tǒng)特異 性表達(dá)Cre重組酶的轉(zhuǎn)基因載體pGFAp一Cre一hGH。通過顯微注射的方法獲得了 7只基因組中整合有pGFAp一Cre一hGH的轉(zhuǎn)基因小鼠(命名為:GFAp一Cre)。PCR 和Southem檢測都證實(shí)7只G刊印一Cre鼠的基因組中的確整合有轉(zhuǎn)入基因。將 G刊企一Cre鼠與ROSA26小鼠進(jìn)行交配，檢測G凡J一Cre鼠中Cre重組酶的表達(dá) J清況。分別選取同時(shí)攜帶有兩種基因發(fā)育至13d的小鼠胚胎和兩周齡小鼠的各 種組織制作切片進(jìn)行LacZ染色。結(jié)果證明只有G刊J一Cre鼠的腦部廣泛表達(dá)有 活性的Cre重組酶，在間腦的脈絡(luò)叢區(qū)表達(dá)尤為集中，具有理想的組織特異性。 我們還構(gòu)建了包含由LoxP序列錨定的neomycin基因組成的阻斷序列、蛻 皮激素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)和截短型人IGF一I的表達(dá)框在內(nèi)的受控型蛻皮激素誘導(dǎo)表 達(dá)人IGF一I的轉(zhuǎn)基因載體pCE一IGF一I。將pCE一IGF一I轉(zhuǎn)染AMI菌感受態(tài)，利 用其中表達(dá)的Cre重組酶將LoxP序列錨定的neomycin基因刪除，解除對(duì)前面 啟動(dòng)子的阻斷作用。再將重組后的載體瞬間轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，加入MuristeroneA 進(jìn)行誘導(dǎo)，經(jīng)W七 Stem檢測證明COS7細(xì)胞中成功地表達(dá)了人IGF一I，在細(xì)胞 水平上證明了該載體的有效性。同樣通過顯微注射的方法獲得6只基因組中整 合有pCE一IGF一I的轉(zhuǎn)基因小鼠(命名為:CE一IGF一I)。pCR和Southem檢測都 證實(shí)6只CE一IGF一I鼠的基因組中的確整合有轉(zhuǎn)入基因。 將GFAP一Cre鼠與CE一IGF一I鼠進(jìn)行交配，選取攜帶有兩種基因的子代鼠， 此類鼠即為我們最后的目的鼠一蛻皮激素誘導(dǎo)截短型人IGF一I在中樞神經(jīng)系統(tǒng) 特異性表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠模型。利用PCR方法檢測證實(shí)腦部特異性表達(dá)的Cre 重組酶介導(dǎo)了其間LoxP位點(diǎn)間neomycin的刪除。利用RT一PCR方法檢測證實(shí) 刪除阻斷序列后蛻皮激素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄激活因子VgEcR和RxR進(jìn) 行了轉(zhuǎn)錄，并且在M麗steroneA誘導(dǎo)后成功地激活了后面表達(dá)框內(nèi)人IGF一I的 轉(zhuǎn)錄。選取經(jīng)MuristeroneA誘導(dǎo)后的轉(zhuǎn)基因鼠腦組織制做切片進(jìn)行免疫組化染 色。染色結(jié)果證明:經(jīng)MuristeroneA誘導(dǎo)后的轉(zhuǎn)基因鼠的腦部成功表達(dá)了人IGF- I，與Cre重組酶的表達(dá)模式相似主要集中在間腦的脈絡(luò)叢區(qū)表達(dá)。
【圖文】：

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