【摘要】： 本文通過(guò)對(duì)已知蛇毒類(lèi)凝血-酶基因的核苷酸序列進(jìn)行同源性分析研究，根據(jù)同源性極高的上游信號(hào)肽保守區(qū)域設(shè)計(jì)合成四條寡聚核苷酸引物，以提取的大連蛇島蝮蛇(Gloyclius shedaoensis)毒腺總RNA為模板，RT-PCR方法合成擴(kuò)增其中的類(lèi)凝血酶基因序列，以設(shè)計(jì)的內(nèi)側(cè)引物為引物，進(jìn)行二次PCR，，對(duì)此PCR產(chǎn)物雙向測(cè)序得到該類(lèi)凝血酶基因的全序列并由此推測(cè)出相應(yīng)的氨基酸序列，基于與不同來(lái)源的類(lèi)凝血酶基因同源性分析比較，推測(cè)出該類(lèi)凝血酶的催化殘基為：HiS~(43)，Asp~(88)，Scr~(182)和Asp~(176)；六對(duì)二硫鍵為：Cys~(7-141)，Cys~(28-44)，Cys~(76-234)，Cys~(120-188)，Cys~(152-167)，和Cys~(178-213)。與其它已知的類(lèi)凝血酶不同，大連蛇島蝮蛇毒類(lèi)凝血酶只含有一個(gè)糖基化位點(diǎn)，即Asn~(100)-Ser~(101)-Thr~(102)。以同樣的方法，得到長(zhǎng)白山白眉蝮蛇(Gloydius ussuriensis)毒類(lèi)凝血酶基因，并比較了它與大連蛇島蝮蛇類(lèi)凝血酶基因序列的差別，發(fā)現(xiàn)兩者的同源性高達(dá)98％，只有三個(gè)氨基酸不同：Gln~(66)．Glu~(66)；Gly~(117)vs．Asp~(117)；Thr~(225)vs．Ile~(225)。由于天然形式存在的兩種酶活性差別較大，說(shuō)明這三個(gè)氨基酸疏水性的改變對(duì)酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響。兩種蛇毒類(lèi)凝血酶的cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列均為首次報(bào)道，并已申請(qǐng)了專(zhuān)利保護(hù)。這兩類(lèi)蛇毒類(lèi)凝血酶基因的成功測(cè)序?yàn)槠浠蚬こ碳捌浣Y(jié)構(gòu)和功能的研究創(chuàng)造了條件。 將大連蛇島蝮蛇和長(zhǎng)白山白眉蝮蛇毒類(lèi)凝血酶基因分別克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pET-32(a)+中，在T7啟動(dòng)子下表達(dá)出融合蛋白，融合部分為硫氧還蛋白，位于類(lèi)凝血酶基因上游，并在其N(xiāo)端帶6xHis Tag標(biāo)簽以利于表達(dá)產(chǎn)物的分離純化，經(jīng)熱激轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21(DE3)中，IPTG誘導(dǎo)斗小時(shí)后收獲菌體。經(jīng)SDS-PAGE，親和層析及電鏡分析，表達(dá)產(chǎn) 摘 蟄 物主要以可溶性的蛋白質(zhì)形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。 首次將大連蛇島賅蛇毒類(lèi)凝血酶成熟基回克隆到表達(dá)載體pPICgK 中，經(jīng)電激轉(zhuǎn)化至畢氏酵母菌株GS15 中，再經(jīng)甲醇誘導(dǎo)，在150ml搖 瓶畔1獲得細(xì)胞外分泌表達(dá)產(chǎn)物。對(duì)菌體培養(yǎng)條件進(jìn)行的探索表明：蛋白 表達(dá)的最佳pH值應(yīng)為6刀，最佳誘導(dǎo)時(shí)問(wèn)為36小時(shí)，培養(yǎng)基為營(yíng)養(yǎng)豐 富的復(fù)合培養(yǎng)基。表達(dá)產(chǎn)物的活性趣過(guò)檢測(cè)其精氨酸酯酶活性和纖維蛋 白原的凝結(jié)活性確定，表達(dá)量通過(guò)精氨酸酯酶活性估算約為4mg／l（培養(yǎng) 液）。 為研究重組類(lèi)凝血酶的純化方法，選取含大連蛇島蝗蛇類(lèi)凝血酶基 囚的畢氏酵母，其表現(xiàn)型為甲醇快速生長(zhǎng)型 h“Mllt”的表達(dá)菌株，在 500ml 搖瓶中培養(yǎng)，甲醇誘導(dǎo)分泌表達(dá)。上清液中重組蝗蛇毒類(lèi)激血酶 的純化是通過(guò)設(shè)計(jì)的不同分離純化方法組合進(jìn)行的，并對(duì)每一種組合進(jìn) 行了活力與純度及口收率的評(píng)價(jià)，結(jié)果表明兩種組合方式都具有一定的 實(shí)用性和可操作性。 通過(guò)對(duì)類(lèi)）疑血酶與胰蛋白酶的同源性分析比較，發(fā)現(xiàn)二者的催化部 位結(jié)構(gòu)非常相似，井且被相同的小分子化合物benzamidne競(jìng)爭(zhēng)性抑制， 首次設(shè)計(jì)將用于親和分離胰蛋白酶的benzamidine 用到純化類(lèi)7疑血酶上 來(lái)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明分離達(dá)到了較好的效果。 與天然蛇毒類(lèi)凝血酶一致，當(dāng)用三肽p山itroanilide衍生物作為底物 時(shí)，分泌表達(dá)的重組大連蛇島蝗蛇毒類(lèi)凝血酶具有較強(qiáng)的生色底物活性， 但用精氨酸甲酯如 TAME（N a－廠－tosyl－L－ar。Inine ethyl ester）M BAE＊ N a－benzoyl－L－arglnlne ethyl ester）作為底物時(shí)，其酶水解活性較弱。 此重組類(lèi)凝血酶在37T中性溶液中保存過(guò)夜將分解成小肽，但在0T下 很穩(wěn)定。該酶催化反應(yīng)的最適pH為8．0，pl為3．5，分子量為28kDa，含 有糖基。根據(jù)分子量的差異計(jì)算糖基化率為7％，其N(xiāo)一末端氨基酸序列 且l JM If 分析不齊整。重組類(lèi)凝血酶的熱穩(wěn)定性較差，去糖基后更加不穩(wěn)定；；
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類(lèi)號(hào)】：Q785

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本文編號(hào)：2666745