【摘要】： 本文通過對已知蛇毒類凝血-酶基因的核苷酸序列進(jìn)行同源性分析研究，根據(jù)同源性極高的上游信號肽保守區(qū)域設(shè)計合成四條寡聚核苷酸引物，以提取的大連蛇島蝮蛇(Gloyclius shedaoensis)毒腺總RNA為模板，RT-PCR方法合成擴(kuò)增其中的類凝血酶基因序列，以設(shè)計的內(nèi)側(cè)引物為引物，進(jìn)行二次PCR，，對此PCR產(chǎn)物雙向測序得到該類凝血酶基因的全序列并由此推測出相應(yīng)的氨基酸序列，基于與不同來源的類凝血酶基因同源性分析比較，推測出該類凝血酶的催化殘基為：HiS~(43)，Asp~(88)，Scr~(182)和Asp~(176)；六對二硫鍵為：Cys~(7-141)，Cys~(28-44)，Cys~(76-234)，Cys~(120-188)，Cys~(152-167)，和Cys~(178-213)。與其它已知的類凝血酶不同，大連蛇島蝮蛇毒類凝血酶只含有一個糖基化位點(diǎn)，即Asn~(100)-Ser~(101)-Thr~(102)。以同樣的方法，得到長白山白眉蝮蛇(Gloydius ussuriensis)毒類凝血酶基因，并比較了它與大連蛇島蝮蛇類凝血酶基因序列的差別，發(fā)現(xiàn)兩者的同源性高達(dá)98％，只有三個氨基酸不同：Gln~(66)．Glu~(66)；Gly~(117)vs．Asp~(117)；Thr~(225)vs．Ile~(225)。由于天然形式存在的兩種酶活性差別較大，說明這三個氨基酸疏水性的改變對酶的高級結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響。兩種蛇毒類凝血酶的cDNA序列及推導(dǎo)的氨基酸序列均為首次報道，并已申請了專利保護(hù)。這兩類蛇毒類凝血酶基因的成功測序?yàn)槠浠蚬こ碳捌浣Y(jié)構(gòu)和功能的研究創(chuàng)造了條件。 將大連蛇島蝮蛇和長白山白眉蝮蛇毒類凝血酶基因分別克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pET-32(a)+中，在T7啟動子下表達(dá)出融合蛋白，融合部分為硫氧還蛋白，位于類凝血酶基因上游，并在其N端帶6xHis Tag標(biāo)簽以利于表達(dá)產(chǎn)物的分離純化，經(jīng)熱激轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21(DE3)中，IPTG誘導(dǎo)斗小時后收獲菌體。經(jīng)SDS-PAGE，親和層析及電鏡分析，表達(dá)產(chǎn) 摘 蟄 物主要以可溶性的蛋白質(zhì)形式存在于細(xì)胞質(zhì)中。 首次將大連蛇島賅蛇毒類凝血酶成熟基回克隆到表達(dá)載體pPICgK 中，經(jīng)電激轉(zhuǎn)化至畢氏酵母菌株GS15 中，再經(jīng)甲醇誘導(dǎo)，在150ml搖 瓶畔1獲得細(xì)胞外分泌表達(dá)產(chǎn)物。對菌體培養(yǎng)條件進(jìn)行的探索表明：蛋白 表達(dá)的最佳pH值應(yīng)為6刀，最佳誘導(dǎo)時問為36小時，培養(yǎng)基為營養(yǎng)豐 富的復(fù)合培養(yǎng)基。表達(dá)產(chǎn)物的活性趣過檢測其精氨酸酯酶活性和纖維蛋 白原的凝結(jié)活性確定，表達(dá)量通過精氨酸酯酶活性估算約為4mg／l（培養(yǎng) 液）。 為研究重組類凝血酶的純化方法，選取含大連蛇島蝗蛇類凝血酶基 囚的畢氏酵母，其表現(xiàn)型為甲醇快速生長型 h“Mllt”的表達(dá)菌株，在 500ml 搖瓶中培養(yǎng)，甲醇誘導(dǎo)分泌表達(dá)。上清液中重組蝗蛇毒類激血酶 的純化是通過設(shè)計的不同分離純化方法組合進(jìn)行的，并對每一種組合進(jìn) 行了活力與純度及口收率的評價，結(jié)果表明兩種組合方式都具有一定的 實(shí)用性和可操作性。 通過對類）疑血酶與胰蛋白酶的同源性分析比較，發(fā)現(xiàn)二者的催化部 位結(jié)構(gòu)非常相似，井且被相同的小分子化合物benzamidne競爭性抑制， 首次設(shè)計將用于親和分離胰蛋白酶的benzamidine 用到純化類7疑血酶上 來，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明分離達(dá)到了較好的效果。 與天然蛇毒類凝血酶一致，當(dāng)用三肽p山itroanilide衍生物作為底物 時，分泌表達(dá)的重組大連蛇島蝗蛇毒類凝血酶具有較強(qiáng)的生色底物活性， 但用精氨酸甲酯如 TAME（N a－廠－tosyl－L－ar。Inine ethyl ester）M BAE＊ N a－benzoyl－L－arglnlne ethyl ester）作為底物時，其酶水解活性較弱。 此重組類凝血酶在37T中性溶液中保存過夜將分解成小肽，但在0T下 很穩(wěn)定。該酶催化反應(yīng)的最適pH為8．0，pl為3．5，分子量為28kDa，含 有糖基。根據(jù)分子量的差異計算糖基化率為7％，其N一末端氨基酸序列 且l JM If 分析不齊整。重組類凝血酶的熱穩(wěn)定性較差，去糖基后更加不穩(wěn)定；；
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號】：Q785

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