【摘要】： 目的 長期以來，在神經(jīng)領(lǐng)域的科學(xué)家們一直對生物包括人類本身在接受外界所給予的刺激后都能迅速有效的作出相應(yīng)反應(yīng)的過程表現(xiàn)出了濃厚的興趣。當(dāng)前世界上有數(shù)量眾多的實(shí)驗(yàn)機(jī)構(gòu)和專業(yè)研究人員在此領(lǐng)域內(nèi)進(jìn)行各個(gè)相關(guān)分支的研究。過去的幾十年來，研究人員取得了很多令人鼓舞的研究成果。在那些科學(xué)家中，Eric kandel和Samuel Schacher都是成就卓著的科學(xué)家。早在上世紀(jì)50年代，當(dāng)時(shí)還是神經(jīng)科醫(yī)生的Eric kandel就發(fā)現(xiàn)了海生動物Aplysia是一種可以作為不同神經(jīng)元之間信號傳導(dǎo)研究的十分理想的目標(biāo)。本世紀(jì)70年代，Samuel schacher等人經(jīng)過三年的摸索，最終成功的建立了將單個(gè)的感覺神經(jīng)細(xì)胞(SN)和單個(gè)的運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞(MN)連接起來，并且可以在體外培養(yǎng)的反射弧模型。近二十年來，研究人員利用這種模型進(jìn)行了很多重要的實(shí)驗(yàn)研究并取得了豐碩的成果。 這其中有相當(dāng)一部分研究工作的結(jié)果表明，有些中樞神經(jīng)(SNS)系統(tǒng)中的特定突觸聯(lián)系是通過細(xì)胞和分子的相互作用過程而建立起來的。突觸的建立(Formation)和維持依賴于眾多基因的相應(yīng)表達(dá)。進(jìn)一步說，某些突觸聯(lián)系有賴于特定基因編碼的蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)運(yùn)到神經(jīng)細(xì)胞的特定區(qū)域(Local site)的一系列復(fù)雜過程。 近十年來，許多科學(xué)家傾向于認(rèn)為，在Aplysia的DNA序列內(nèi)中存在的由Sensorin基因序列所負(fù)責(zé)編碼的特定蛋白質(zhì)在突觸之間的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，可能與突觸的形成(Formation)和穩(wěn)定(Stability)有關(guān)，并且與突觸的長時(shí)程強(qiáng)化(LTF)之間有某種程度的聯(lián)系，而且這種蛋白質(zhì)的運(yùn)輸過程可能與感覺信號由感覺神經(jīng)(SN，突觸前)通過突觸間隙傳遞到運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞(MN，突觸后)，并與產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)行為等一系列生理，生化和分子生物學(xué)反應(yīng)有密切的關(guān)系。 盡管很多研究人員在這個(gè)研究方向上付出了不懈的努力，但是由這種基因編碼的蛋白質(zhì)始終沒有被人們在突觸中明確的找到。這樣的結(jié)果導(dǎo)致了對于感知、學(xué)習(xí)、記憶和行為等諸多生理心理過程的研究顯得進(jìn)展緩慢。 因此我們的研究旨在從離體培養(yǎng)的突觸(Isohted SynaPse)內(nèi)標(biāo)記出這 種蛋白質(zhì)，并探索不同的生理?xiàng)l件對此特定蛋白合成(乃mtein synthesis)過 程的影響。 方法 Aplvsia細(xì)胞的培養(yǎng): Aplrsia感覺神經(jīng)元(SN)從成年動物的神經(jīng)節(jié)分離出來。A兩sia運(yùn)動 神經(jīng)元(L7L 11)從幼年動物的腹部神經(jīng)節(jié)中取得。在特定的培養(yǎng)皿中將 兩個(gè)細(xì)胞的軸突相接觸，建立體外的反射弧模型，分別為SN/L7模式(用做 實(shí)驗(yàn)組)和SN/Lll模式(用做對照組)。并在特定條件下培養(yǎng)1一3天，之后 模型可以被.應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)。 在本實(shí)驗(yàn)中，我們建立這樣的體外細(xì)胞培養(yǎng)模式，即在培養(yǎng)皿中分別把 兩個(gè)感覺神經(jīng)細(xì)胞(SNS)和運(yùn)動神經(jīng)細(xì)胞L7連接，使其建立穩(wěn)定的突觸聯(lián) 系。在測定感覺神經(jīng)細(xì)胞誘發(fā)的興奮性突觸后電位(EPSP)后-一種用來檢 測突觸效率的的電生理指標(biāo)。切除其中一個(gè)感覺神經(jīng)細(xì)胞(SN)的胞體，然 后繼續(xù)體外(In vivo)的培養(yǎng)過程。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，分別用突觸長時(shí)程強(qiáng) 化(LTF)刺激物質(zhì)5一經(jīng)色胺(5一HT)和蛋白質(zhì)合成抑制劑一茵香霉素(Aniso- mycin)以及對照試劑來處理。 標(biāo)準(zhǔn)的電生理技術(shù): 用來記錄感覺神經(jīng)元(SN)在運(yùn)動神經(jīng)元(L7)激發(fā)出來的動作電位 (EPSP)，感覺神經(jīng)細(xì)胞的動作電位不會在運(yùn)動細(xì)胞(Lll)中誘發(fā)出相應(yīng)的 動作電位。這是體外細(xì)胞培養(yǎng)SN/Lll模式可以作為本實(shí)驗(yàn)對照的理論基 礎(chǔ)。 免疫組織化學(xué)技術(shù): 培養(yǎng)標(biāo)本經(jīng)過漂洗(Wash out)，，固定(F議ed)后室溫放置。經(jīng)過減低背 景(Blocking)處理。然后應(yīng)用一抗(Prim娜antibody)標(biāo)記，在攝氏4度下過 夜。次日經(jīng)過三次漂洗后再應(yīng)用二抗(second娜antibody)標(biāo)記處理，室溫 下放置一小時(shí)，然后再漂洗，完成后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果并拍照記錄。 結(jié)果 離體培養(yǎng)的突觸(Isolated synapses)表達(dá)長時(shí)程強(qiáng)化(LTF)，這種長時(shí) 程強(qiáng)化具有兩個(gè)重要特征:第一是它會表現(xiàn)出迅速的衰減;第二是它依賴 于蛋白質(zhì)的合成。 表達(dá)長時(shí)程強(qiáng)化(LrF)的離體突觸(isolated synapse)，經(jīng)過5，翹色胺 (5一HT)處理24小時(shí)以后進(jìn)行觀察和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，我們發(fā)現(xiàn)，在與同一個(gè) 運(yùn)動神經(jīng)元(L7)相連的的兩個(gè)感覺神經(jīng)細(xì)胞(SNS)之間，此種突觸模式為 ZSNS/L7，被切除胞體的感覺神經(jīng)元(SN)所表達(dá)的長時(shí)期程強(qiáng)化(LTF)， 與仍然保留胞體的的感覺神經(jīng)元(SN)相比較有明顯的增加。誘發(fā)性突觸 后電位(E玲P)數(shù)值: 205，1(12.2%(5一HT一CB)。 154.3(6.0%(5一HT CB) 兩組數(shù)據(jù)間差異明顯(p0.05)。 離體培養(yǎng)并被切除胞體的感覺神經(jīng)細(xì)胞(SN)表達(dá)的長時(shí)程強(qiáng)化 (LTF)同未被切除胞體的感覺神經(jīng)元(SN)在應(yīng)用5一經(jīng)色胺(5一HT)的條件 下相互比較，前者持續(xù)的時(shí)間相對短暫(Transient)。本實(shí)驗(yàn)取48小時(shí)做為 時(shí)間位點(diǎn)，我們進(jìn)行由上述二組實(shí)驗(yàn)中測出的誘發(fā)性突觸后電位(EPSP)的 數(shù)據(jù)比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn): 無胞體實(shí)驗(yàn)組經(jīng)過5一經(jīng)色胺(5一HT一CB)處理(Isolated synapse)的均值 為:124.9土1 1.1%。 而應(yīng)用5一經(jīng)色胺(5一HT+CB)并保留細(xì)胞體的實(shí)驗(yàn)組在48小時(shí)的數(shù)據(jù) 為106.5土6.2%，二者并無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差
【圖文】：

KelseyM翻n建立了用單個(gè)感覺神經(jīng)細(xì)胞與兩個(gè)運(yùn)動神經(jīng)元連接的細(xì)胞培養(yǎng)模型[50，sl]。見下圖。綜述圖4注:圖中兩個(gè)比較大的細(xì)胞為運(yùn)動神經(jīng)元，中間相對較小的細(xì)胞為感覺神經(jīng)元，它通過末梢與兩個(gè)運(yùn)動神經(jīng)元都建立起了聯(lián)系。上圖右側(cè)，研究人員正向標(biāo)本施加Serotonin(5一盯)，左側(cè)為對照。通過這個(gè)模型，人們進(jìn)一步確認(rèn)了，持續(xù)的長時(shí)間的突觸特異性強(qiáng)化過程要求CREB的參與，并且引起了突觸結(jié)構(gòu)的改變。長時(shí)程突觸強(qiáng)化可以有5一HT來激發(fā)。這些結(jié)果使研究人員相信，外界的刺激信號所引發(fā)的短時(shí)過程具有兩個(gè)特征:當(dāng)僅僅產(chǎn)生短時(shí)程變化的時(shí)候，它可以提供突觸特異的突觸強(qiáng)度的增加，此過程與短時(shí)記憶有關(guān)，持續(xù)幾分鐘。而當(dāng)CREB誘發(fā)同一個(gè)神經(jīng)元的不同突觸聯(lián)系產(chǎn)生長時(shí)程過程時(shí)，刺激可以將那些被誘發(fā)的突觸標(biāo)記出來，這些被標(biāo)記出的突觸可以利用CREB激發(fā)的蛋白質(zhì)來保證突觸的成長，產(chǎn)生突觸強(qiáng)度上的永久性的改變。近年來，許多研究人員在探索5一解的作用機(jī)制上做了很多有益的工作.B汕a。和easteuueei[”〕發(fā)現(xiàn)
【學(xué)位授予單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號】：R329

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2665976