【摘要】： 目的 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell, Treg)是具有免疫負(fù)調(diào)控作用的T亞群,它在維持外周免疫耐受,控制自身免疫性疾病、過敏反應(yīng)和誘導(dǎo)移植耐受等方面發(fā)揮重要的保護(hù)作用,成為近幾年來免疫學(xué)的研究熱點(diǎn)之一。目前,在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的研究中,對(duì)CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(CD4+CD25+Treg)的特性研究得較多。已知CD4+CD25+Treg主要有兩大類：一類是天然CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(natural occurring regulatory T cell, nTreg),在胸腺中產(chǎn)生,存在于正常機(jī)體內(nèi),在小鼠脾臟和人外周血中占CD4+T細(xì)胞的5-10%；另一種是誘導(dǎo)性CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(inducible regulatory T cell, iTreg),在外周合適的條件(如TCR刺激和細(xì)胞因子TGF-β或IL-10)下可以由CD4+CD25-T細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來。iTreg與nTreg具有相同的表面標(biāo)記和抑制功能,主要標(biāo)記有CTLA-4、GITR和Foxp3,其中轉(zhuǎn)錄因子Foxp3是目前廣為應(yīng)用的Treg最重要的特異性標(biāo)志,不僅是后者分化發(fā)育的標(biāo)志,更是其功能性標(biāo)志。近年來,利用Treg的免疫抑制效應(yīng)控制機(jī)體過度或不適的免疫應(yīng)答進(jìn)而防治疾病成為免疫治療的新策略。然而,有限的Treg數(shù)量限制了Treg的臨床應(yīng)用,因此尋找擴(kuò)增或誘導(dǎo)CD4+CD25+Treg的有效方法,并深入探索其機(jī)制,成為推動(dòng)Treg臨床應(yīng)用的前提和基礎(chǔ)。 樹突狀細(xì)胞(dendritic cells, DCs)是機(jī)體重要的抗原遞呈細(xì)胞。已有的研究顯示DCs不僅在效應(yīng)性T細(xì)胞的活化和增殖方面發(fā)揮重要作用,而且具有擴(kuò)增和誘導(dǎo)Treg產(chǎn)生的作用。負(fù)載抗原的DCs在外源性IL-2存在的情況下可以擴(kuò)增nTreg；在細(xì)胞因子如TGF-β、IL-10或Vitamin D等存在的情況下,DCs可以將CD4+CD25-T細(xì)胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化為Foxp3+Treg。然而,在這些誘導(dǎo)和擴(kuò)增的實(shí)驗(yàn)方法中,CD4+CD25-T細(xì)胞和CD4+CD25+T細(xì)胞都需要從CD4+T細(xì)胞群體中分離純化出來,然后在體外加入不同的外源性細(xì)胞因子進(jìn)行誘導(dǎo)或擴(kuò)增,使得整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程變得復(fù)雜化而且成本也相對(duì)較高。既然CD4+T細(xì)胞群體不僅含有CD4+CD25+的nTreg,也含有CD4+CD25-的iTreg前體細(xì)胞,那么我們是否可以不加外源性細(xì)胞因子,不需分離純化而利用DCs直接刺激CD4+T細(xì)胞群體產(chǎn)生Treg?故本研究的目的一是探索DCs是否可直接從CD4+群體中產(chǎn)生Treg,哪種類型DCs(同種同型與同種異型、未成熟與成熟)作用最強(qiáng),機(jī)制如何?進(jìn)而建立簡(jiǎn)便、價(jià)廉的產(chǎn)生Treg的方法,推動(dòng)Treg的臨床應(yīng)用。 DCs在體內(nèi)分化、成熟和發(fā)揮作用時(shí)常常處于不同的微環(huán)境,氧壓是微環(huán)境中的重要因素。生理或病理情況下組織細(xì)胞經(jīng)常處于不同氧壓的微環(huán)境,如在動(dòng)脈栓塞、器官移植過程中,早期局部組織是處于一種遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于大氣氧壓的低氧或乏氧狀態(tài)。當(dāng)外界因素撤除或手術(shù)致使原本處于低氧狀態(tài)的組織血流通暢,氧供隨之恢復(fù),即發(fā)生再氧合。這種乏氧-再氧合的病理生理過程,經(jīng)常見于缺血再灌注損傷。那么不同氧壓對(duì)DCs的分化成熟及功能有何影響?不同氧壓微環(huán)境中產(chǎn)生的DCs對(duì)T細(xì)胞分化特別是對(duì)Treg分化有何影響?目前都尚不清楚。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)乏氧可抑制DCs的表型成熟和對(duì)T細(xì)胞的刺激功能。故本課題的目的二是在前期研究的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步研究乏氧-再氧合條件下小鼠DCs表型及功能變化,分析再氧合DCs對(duì)Th細(xì)胞及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化影響,并對(duì)其內(nèi)在分子機(jī)制進(jìn)行探討。這為解釋缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制,控制器官移植的排斥反應(yīng)以及腫瘤免疫治療奠定一定的基礎(chǔ)。 總之,本課題包括兩部分內(nèi)容：一、同種異型DCs在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞產(chǎn)生中的作用及其機(jī)制研究；二、再氧合DCs在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞產(chǎn)生中的作用及其機(jī)制研究。 第一部分同種異型DCs在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞產(chǎn)生中的作用及其機(jī)制研究 方法 一、小鼠骨髓來源DCs的誘導(dǎo) 1.分離C57BL／6或BALB／c小鼠的骨髓細(xì)胞,利用細(xì)胞因子GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)BM-DCs。 2.隔2天半量換液,第6天時(shí)給予LPS(1μg／ml)刺激24h,以誘導(dǎo)成熟。 二、自體DCs或同種異型DCs刺激CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生Treg的能力 1.用免疫磁珠分離純化BALB／c小鼠脾臟CD4+T細(xì)胞,分別與自體(同基因型)DCs或同種異型DCs共培養(yǎng)。 2.流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)培養(yǎng)體系中CD4+CD25+Treg的比例。 三、人外周血單個(gè)核細(xì)胞來源的DCs刺激CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生Treg的能力 1.獲取不同人外周血10-15m1,分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)。 2.免疫磁珠法分離CD4+T細(xì)胞。 3.PBMC靜置2h后去除未貼壁細(xì)胞,給予重組人GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)成DCs。 4.將不同人的CD4+T細(xì)胞與DCs做同種異型或自體的細(xì)胞共培養(yǎng)。 5.流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)培養(yǎng)體系中CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例。 四、增殖抑制試驗(yàn)檢測(cè)CD4+CD25+Treg的抑制功能 1.將第一步中同種異型混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生的Treg (generated Treg)純化后作為抑制細(xì)胞,同種異型DCs作為刺激細(xì)胞,標(biāo)記了CFSE的CD4+CD25-T細(xì)胞作為反應(yīng)細(xì)胞,反應(yīng)細(xì)胞：抑制細(xì)胞按照不同比例共培養(yǎng)。 2.新鮮分離的天然Treg作為實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照,流式檢測(cè)反應(yīng)細(xì)胞的增殖情況。 五、細(xì)胞因子在CD4+CD25+Treg產(chǎn)生中的作用 (一)探索IL-2在同種異型DCs刺激Treg產(chǎn)生中的作用 1.分離小鼠脾臟CD4+CD25+T細(xì)胞,標(biāo)記CFSE,與同種異型DCs共培養(yǎng),并給予IL-2刺激,5天后FCM檢測(cè)同種異型DCs對(duì)CD4+CD25+T細(xì)胞的增殖情況。 2.分離CD4+CD25+T細(xì)胞,標(biāo)記CFSE,然后與CD4+CD25-T細(xì)胞按照原來比例混合成CD4+T細(xì)胞整體,與同種異型DCs共培養(yǎng),培養(yǎng)5天后收集上清,ELISA檢測(cè)IL-2的水平。 3.IL-2阻斷試驗(yàn)：上述體系中加入抗IL-2的中和性抗體,對(duì)照組加入同型對(duì)照IgG,5天后流式檢測(cè)CD4+CD25+T細(xì)胞的增殖情況。 (二)探索TGF-p在同種異型DCs刺激Treg產(chǎn)生中的作用 1.分離小鼠脾臟CD4+CD25-T細(xì)胞,標(biāo)記CFSE,與同種異型DCs共培養(yǎng),不同時(shí)間后流式檢測(cè)Foxp3的表達(dá)和CFSE的情況。 2.收集不同時(shí)間的上清,ELISA檢測(cè)TGF-p水平。 3.TGF-p阻斷試驗(yàn)：上述體系中加入不同濃度的TGF-p受體Ⅰ激酶抑制劑Ⅱ(ALK-5抑制劑Ⅱ),培養(yǎng)5天后檢測(cè)Foxp3的表達(dá)。 結(jié)果 一、在無外源性細(xì)胞因子存在的情況下,小鼠同種異型DCs可刺激CD4+T細(xì)胞高效產(chǎn)生Treg,但自體DCs無此作用 新鮮純化的CD4+T細(xì)胞純度大于95%,其中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的比例小于10%。自體BM-DCs與抗CD3抗體聯(lián)合刺激CD4+T細(xì)胞3-5天后,T細(xì)胞大量活化,CD4+CD25+T細(xì)胞的比例明顯增加(90%),但其中Foxp3+T細(xì)胞的比例仍然小于10%。然而,用同種異型BM-DCs刺激CD4+T細(xì)胞后,盡管活化的CD4+CD25+T細(xì)胞的比例較自體DCs刺激體系低(50%-70%),然而其中Foxp3+T細(xì)胞的比例高達(dá)80%以上。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),體系中CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的比例增加5-7倍。值得注意的是,未成熟同種異型DCs和成熟同種異型DCs刺激CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生Treg的能力無明顯差異。 二、人同種異型DCs在沒有外源性細(xì)胞因子的情況下,同樣可以增加CD4+T細(xì)胞中Treg的比例 為了進(jìn)一步證明同種異型DCs刺激Treg產(chǎn)生的能力,我們從人PBMC中用重組人GM-CSF和IL-4分別誘導(dǎo)同種異型或自體DCs,與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng),流式檢測(cè)體系中CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例。結(jié)果顯示,自體DCs活化的CD4+CD25+T細(xì)胞中Foxp3+細(xì)胞表達(dá)在10%左右,而同種異型DCs活化的CD4+CD25+T細(xì)胞中Foxp3+Treg的比例高達(dá)40%左右,其作用與小鼠的同種異型DCs相似。 三、同種異型DCs產(chǎn)生的Treg在體外具有抑制功能 為了進(jìn)一步證明同種異型DCs刺激產(chǎn)生的Treg (generated Treg)在體外是否保持其特有的抑制功能,我們將小鼠同種異型DCs刺激產(chǎn)生的CD4+CD25+T細(xì)胞純化后作為抑制細(xì)胞,按照不同比例與反應(yīng)細(xì)胞CD4+CD25-T細(xì)胞共培養(yǎng),一定時(shí)間后流式檢測(cè)反應(yīng)細(xì)胞的增殖情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn),同種異型DCs刺激產(chǎn)生的Treg在體外具有明顯的抑制功能,與新鮮分離的nTreg一致。 四、內(nèi)源性IL-2和TGF-β在同種異型DCs刺激CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生Treg中發(fā)揮重要作用 為了探討同種異型DCs刺激CD4+T細(xì)胞高效產(chǎn)生Treg的機(jī)制,我們進(jìn)一步研究了內(nèi)源性IL-2和TGF-β在同種異型DCs刺激CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生Treg中的作用。 1.IL-2在同種異型DCs刺激Treg擴(kuò)增中發(fā)揮重要作用 1)用CFSE標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)證明在外源性IL-2存在的情況下,DCs可以有效的擴(kuò)增nTreg 分離純化CD4+CD25+T細(xì)胞后用CFSE標(biāo)記,然后與同種異型BM-DCs共培養(yǎng),并給予外源性IL-2刺激,5天后流式檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,發(fā)現(xiàn)同種異型DCs可以有效擴(kuò)增CD4+T細(xì)胞中的nTreg。 2)用抗體阻斷的方法證明內(nèi)源性的IL-2在同種異型DCs刺激Treg擴(kuò)增中發(fā)揮重要作用 分離純化CD4+CD25+T細(xì)胞后用CFSE標(biāo)記,然后與CD4+CD25-T細(xì)胞按照原有的比例混合,與同種異型BM-DCs共培養(yǎng),ELISA檢測(cè)上清中細(xì)胞因子IL-2的水平,發(fā)現(xiàn)同種異型DCs刺激組中IL-2的水平明顯高于對(duì)照組。為了進(jìn)一步驗(yàn)證體系中IL-2的作用,在如上體系中同時(shí)加入抗IL-2的中和抗體,5天后收集細(xì)胞,流式檢測(cè)細(xì)胞CFSE增殖情況,發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組IgG相比,IL-2阻斷抗體可以明顯抑制CD4+T細(xì)胞群體中CD4+CD25+T細(xì)胞的增殖。這說明同種異型DCs對(duì)CD4+CD25+Treg的有效擴(kuò)增依賴于體系中的內(nèi)源性IL-2。 2.TGF-β在同種異型DCs誘導(dǎo)Treg產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用 1)用CFSE標(biāo)記和流式術(shù)證明同種異型DCs可以誘導(dǎo)Treg的產(chǎn)生 新鮮分離小鼠脾臟CD4+CD25-T細(xì)胞,用CFSE標(biāo)記,然后與同種異型BM-DCs共培養(yǎng)不同時(shí)間后,收集細(xì)胞,流式檢測(cè)Foxp3的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,第5天時(shí),同種異型DCs刺激的CD4+CD25-T細(xì)胞與新鮮分離的CD4+CD25-T細(xì)胞相比,Foxp3+T細(xì)胞比例明顯增加。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),Foxp3+T細(xì)胞比例逐漸增加。當(dāng)培養(yǎng)到第13天時(shí),Foxp3的表達(dá)達(dá)到第5天時(shí)的兩倍。這表明在沒有外源性TGF-p存在的情況下,同種異型DCs可以誘導(dǎo)CD4+CD25-T向CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞轉(zhuǎn)化。 2)同種異型DCs刺激體系中存在內(nèi)源性TGF-β的產(chǎn)生 收集培養(yǎng)不同時(shí)間的上清,ELISA檢測(cè)上清中TGF-p的水平,結(jié)果提示,培養(yǎng)到第5天時(shí),總的TGF-p水平明顯增加。并隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),其水平逐漸升高。當(dāng)培養(yǎng)第13天時(shí),TGF-β水平達(dá)到第5天時(shí)的2-3倍。 3)用抑制劑阻斷的方法證明內(nèi)源性TGF-β在同種異型DCs刺激Treg產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用 為進(jìn)一步驗(yàn)證產(chǎn)生的TGF-p在CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞誘導(dǎo)中的作用,我們?cè)谌缟象w系中加入不同濃度的TGF-p受體Ⅰ激酶抑制劑Ⅱ(ALK-5抑制劑Ⅱ),定時(shí)間后,流式檢測(cè)Foxp3的表達(dá)。結(jié)果顯示,體系中CD4+Foxp3high T細(xì)胞的百分比和絕對(duì)數(shù)隨著ALK-5抑制劑Ⅱ濃度的增加而逐漸降低,且CD4+Foxp3dim T細(xì)胞的百分比和絕對(duì)數(shù)顯著下降,與加入的ALK-5抑制劑Ⅱ濃度具有明顯的劑量依賴關(guān)系。所以我們推測(cè)CD4+Foxp3dim T細(xì)胞可能是轉(zhuǎn)化的Foxp3+T細(xì)胞的潛在群體,且TGF-p在轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著重要的作用。 結(jié)論 1.小鼠同種異型BM-DCs和人PBMC誘導(dǎo)的同種異型DCs,在無外源性細(xì)胞因子的情況下,都可以增加CD4+T細(xì)胞中Treg的比例,產(chǎn)生的Treg在體外對(duì)T細(xì)胞增殖具有抑制功能。 2.同種異型BM-DCs刺激的體系中,內(nèi)源性IL-2和TGF-p在Treg的產(chǎn)生中發(fā)揮著重要的作用。 創(chuàng)新性和意義 1.首次發(fā)現(xiàn)同種異型BM-DCs在沒有外源性細(xì)胞因子的情況下可以刺激CD4+T細(xì)胞高效產(chǎn)生Treg,并探討了其機(jī)制。 2.首次將CD4+T細(xì)胞作為一個(gè)整體來尋找獲得足夠數(shù)量Treg的方法,為優(yōu)化后續(xù)研究的實(shí)驗(yàn)方法、制定Treg的臨床治療策略提供了一定的理論依據(jù)。 研究的局限性 1.同種異型BM-DCs刺激CD4+T細(xì)胞產(chǎn)生Treg的具體內(nèi)在分子調(diào)控機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。 2.所獲得Treg應(yīng)用于臨床,其條件仍需進(jìn)一步優(yōu)化。 第二部分再氧合DCs在調(diào)節(jié)性T細(xì)胞產(chǎn)生中的作用及其機(jī)制研究 方法 一、再氧合對(duì)DCs的表型影響 1.分離C57BL／6小鼠骨髓細(xì)胞,分別在常、乏氧條件下利用GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)DCs,并給予LPS刺激。 2.對(duì)乏氧條件下分化的DCs進(jìn)行再氧合不同時(shí)間。 3.流式檢測(cè)再氧合DCs表面協(xié)同刺激分子及MHC-Ⅱ類分子的表達(dá)。 二、再氧合對(duì)DCs的Th細(xì)胞增殖、分化的影響 1.分離CD4+T細(xì)胞并標(biāo)記CFSE,與再氧合的同種異型DCs或自體DCs共培養(yǎng),后者給予抗CD3抗體刺激。 2.流式檢測(cè)再氧合DCs刺激CD4+T細(xì)胞增殖的能力。 3.收集細(xì)胞,流式檢測(cè)再氧合DCs刺激CD4+T細(xì)胞的分化情況。 三、再氧合影響DCs表型及功能的分子機(jī)制研究 1.將乏氧下分化的DCs進(jìn)行再氧合,Real time PCR的方法檢測(cè)其表達(dá)四種腺苷受體的mRNA水平。 2.以不同腺苷受體激動(dòng)劑處理再氧合的DCs,流式檢測(cè)其表型的變化。 3.流式檢測(cè)不同濃度A2AR腺苷受體激動(dòng)劑對(duì)再氧合的DCs表型的影響。 4.ELISA檢測(cè)A2AR激動(dòng)劑對(duì)再氧合DCs的細(xì)胞因子表達(dá)的影響。 結(jié)果 一、再氧合可逆轉(zhuǎn)乏氧對(duì)DCs成熟表型的抑制 為了研究再氧合對(duì)DCs表型的影響,我們?cè)诜ρ鯒l件下誘導(dǎo)DCs后對(duì)其進(jìn)行再氧合不同時(shí)間,流式檢測(cè)細(xì)胞表面分子的表達(dá)。結(jié)果顯示乏氧抑制DCs協(xié)同刺激分子CD80、CD86以及MHC-Ⅱ類分子的表達(dá)。再氧合6小時(shí)后其表達(dá)百分比和熒光強(qiáng)度均明顯上調(diào),且熒光強(qiáng)度隨再氧合時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加,再氧合24h、48h可達(dá)到高峰。這提示再氧合可以逆轉(zhuǎn)乏氧對(duì)DCs表型的抑制,促進(jìn)DCs向成熟方向分化。 二、再氧合DCs刺激CD4+T細(xì)胞增殖的能力較乏氧DCs明顯增強(qiáng) 無論是在同種異型混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)體系中,還是在CD3單抗刺激的體系中,乏氧DCs刺激CD4+T細(xì)胞增殖的能力與常氧DCs相比非常弱。再氧合后,其誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞增殖的能力明顯提高。這提示無論針對(duì)同種異型抗原,還是自體抗原,再氧合DCs均具有很強(qiáng)的抗原遞呈功能。 三、再氧合DCs降低Treg的數(shù)量而上調(diào)Th17和Thl細(xì)胞應(yīng)答 進(jìn)一步我們檢測(cè)了同種異型混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)體系中,再氧合的DCs對(duì)CD4+T細(xì)胞分化的影響。結(jié)果顯示,再氧合DCs誘導(dǎo)產(chǎn)生的CD4+CD25+Foxp3+Tregs,與常氧成熟和未成熟DCs相比,明顯減少；相反,再氧合DCs可顯著誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞向IL-17+Th17細(xì)胞分化,其比例明顯高于未成熟DCs,甚至常氧成熟DCs刺激產(chǎn)生的IL-17+Th17細(xì)胞。同時(shí),IFN-γ+Th1細(xì)胞的比例和上清中IFN-γ的水平也明顯高于常氧成熟和未成熟DCs刺激組。我們進(jìn)一步研究了再氧合DCs的細(xì)胞因子分泌情況。結(jié)果證實(shí)再氧合24h的DCs上清中IL-6水平顯著升高,而TGF-p的水平則與乏氧組相比明顯降低。這提示再氧合DCs分泌的細(xì)胞因子更有利于使CD4+T細(xì)胞向Th17方向分化�？傊�,這些結(jié)果表明再氧合DCs具有很強(qiáng)的驅(qū)動(dòng)Th17和Thl細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)的能力。 四、腺苷-A2AR通路在DCs乏氧-再氧合過程中發(fā)揮著重要的作用 1.再氧合可上調(diào)腺苷受體A2AR在DCs的表達(dá),而對(duì)A1R、A2BR及A3R的表達(dá)無明顯影響 為了研究腺苷通路是否參與乏氧-再氧合對(duì)DCs表型和功能的影響,我們首先采用Real time PCR方法檢測(cè)了再氧合DCs的四種腺苷受體的mRNA表達(dá)水平,結(jié)果顯示,與常氧及乏氧DCs相比,再氧合DCs表達(dá)的A2AR水平呈現(xiàn)明顯升高趨勢(shì)；而各組之間A1R、A2BR及A3R的表達(dá)則無明顯變化。 2.A2AR受體激動(dòng)劑可抑制再氧合DCs成熟相關(guān)表型的上調(diào) 為了進(jìn)一步確認(rèn)腺苷通路在乏氧-再氧合對(duì)DCs表型和功能的影響,我們?cè)趯⒎ρ跸路只腄Cs進(jìn)行再氧合時(shí),給予不同腺苷受體激動(dòng)劑刺激,流式檢測(cè)DCs的表型。篩選結(jié)果提示,與對(duì)照組(再氧合組)相比,A2AR受體選擇性激動(dòng)劑CGS21680可以抑制再氧合對(duì)乏氧DCs表型的上調(diào)作用,即抑制MHC-Ⅱ和協(xié)同刺激CD80、CD86的表達(dá)。而A1R、A2BR、A3R的激動(dòng)劑則沒有此功能。 3.A2AR激動(dòng)劑對(duì)再氧合DCs表型的抑制具有濃度依賴性 體外進(jìn)一步檢測(cè)了不同濃度的A2AR受體選擇性激動(dòng)劑CGS21680對(duì)再氧合DCs表型的影響。流式結(jié)果顯示,隨著CGS21680濃度的增加,協(xié)同刺激分子CD80、CD86及MHC-Ⅱ表達(dá)的平均熒光強(qiáng)度逐漸降低,與對(duì)照組相比有顯著性差異,這進(jìn)一步提示A2AR通路確實(shí)在DCs的乏氧-再氧合過程中發(fā)揮著重要的作用。 4.A2AR激動(dòng)劑可明顯抑制再氧合DCs促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生,而上調(diào)抑炎細(xì)胞因子產(chǎn)生 我們進(jìn)一步檢測(cè)了不同腺苷受體激動(dòng)劑對(duì)再氧合DCs的細(xì)胞因子分泌情況,ELISA結(jié)果顯示A2AR選擇性激動(dòng)劑CGS21680可以明顯抑制再氧合DCs炎性細(xì)胞因子IL-1p、IL-6和TNF-a等的分泌,而上調(diào)其免疫抑制因子TGF-p的分泌。這說明腺苷受體通路參與再氧合逆轉(zhuǎn)乏氧對(duì)DCs功能的影響,A2AR受體通路可能是再氧合上調(diào)DCs表型和功能的一個(gè)重要調(diào)節(jié)分子。 結(jié)論 一、再氧合可以逆轉(zhuǎn)乏氧對(duì)DCs成熟表型及功能的抑制作用 1.再氧合可明顯促進(jìn)乏氧下分化DCs的表型成熟。 2.再氧合可明顯促進(jìn)DCs對(duì)同種異型及同種同型抗原的遞呈功能,明顯增強(qiáng)DCs對(duì)CD4+T細(xì)胞增殖的能力,可降低Treg的數(shù)量而促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向Th17和Th1方向分化。 二、腺苷受體通路參與再氧合逆轉(zhuǎn)乏氧對(duì)DCs表型及功能的影響 1.再氧合DCs表達(dá)高水平腺苷受體A2AR。 2.A2AR激動(dòng)劑CGS21680抑制再氧合逆轉(zhuǎn)乏氧對(duì)DCs表型的能力,并具有濃度依賴性。 3.A2AR激動(dòng)劑CGS21680抑制再氧合DCs炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。 創(chuàng)新性和意義 1.首次發(fā)現(xiàn)再氧合可明顯逆轉(zhuǎn)乏氧對(duì)DCs的成熟表型及功能的影響,這為解釋缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制提供有力的證據(jù),證明乏氧-再氧合可能是導(dǎo)致缺血再灌注損傷的內(nèi)在機(jī)制之一。 2.首次發(fā)現(xiàn)A2AR腺苷受體通路抑制再氧合對(duì)乏氧DCs表型及功能的逆轉(zhuǎn)作用,為尋找從免疫學(xué)角度治療缺血再灌注損傷的新策略提供新思路。 研究的局限性 1.腺苷通路參與再氧合促進(jìn)乏氧DCs表型及功能成熟的內(nèi)在分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。 2.腺苷受體激動(dòng)劑應(yīng)用于治療IRI的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)有待于進(jìn)一步補(bǔ)充。
【圖文】：

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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R392

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 Ori Rotstein;;Toll-like receptor 4 involvement in hepatic ischemia/reperfusion injury in mice[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2004年02期

2 ;Role of adhesion molecules and dendritic cells in rat hepatic/renal ischemia-reperfusion injury and anti-adhesive intervention with anti-P-selectin lectin-EGF domain monoclonal antibody[J];World Journal of Gastroenterology;2005年07期

本文編號(hào)：2665306