【摘要】： 目的 調節(jié)性T細胞(regulatory T cell, Treg)是具有免疫負調控作用的T亞群,它在維持外周免疫耐受,控制自身免疫性疾病、過敏反應和誘導移植耐受等方面發(fā)揮重要的保護作用,成為近幾年來免疫學的研究熱點之一。目前,在調節(jié)性T細胞的研究中,對CD4+CD25+調節(jié)性T細胞(CD4+CD25+Treg)的特性研究得較多。已知CD4+CD25+Treg主要有兩大類：一類是天然CD4+CD25+調節(jié)性T細胞(natural occurring regulatory T cell, nTreg),在胸腺中產生,存在于正常機體內,在小鼠脾臟和人外周血中占CD4+T細胞的5-10%；另一種是誘導性CD4+CD25+調節(jié)性T細胞(inducible regulatory T cell, iTreg),在外周合適的條件(如TCR刺激和細胞因子TGF-β或IL-10)下可以由CD4+CD25-T細胞轉化而來。iTreg與nTreg具有相同的表面標記和抑制功能,主要標記有CTLA-4、GITR和Foxp3,其中轉錄因子Foxp3是目前廣為應用的Treg最重要的特異性標志,不僅是后者分化發(fā)育的標志,更是其功能性標志。近年來,利用Treg的免疫抑制效應控制機體過度或不適的免疫應答進而防治疾病成為免疫治療的新策略。然而,有限的Treg數(shù)量限制了Treg的臨床應用,因此尋找擴增或誘導CD4+CD25+Treg的有效方法,并深入探索其機制,成為推動Treg臨床應用的前提和基礎。 樹突狀細胞(dendritic cells, DCs)是機體重要的抗原遞呈細胞。已有的研究顯示DCs不僅在效應性T細胞的活化和增殖方面發(fā)揮重要作用,而且具有擴增和誘導Treg產生的作用。負載抗原的DCs在外源性IL-2存在的情況下可以擴增nTreg；在細胞因子如TGF-β、IL-10或Vitamin D等存在的情況下,DCs可以將CD4+CD25-T細胞誘導轉化為Foxp3+Treg。然而,在這些誘導和擴增的實驗方法中,CD4+CD25-T細胞和CD4+CD25+T細胞都需要從CD4+T細胞群體中分離純化出來,然后在體外加入不同的外源性細胞因子進行誘導或擴增,使得整個實驗過程變得復雜化而且成本也相對較高。既然CD4+T細胞群體不僅含有CD4+CD25+的nTreg,也含有CD4+CD25-的iTreg前體細胞,那么我們是否可以不加外源性細胞因子,不需分離純化而利用DCs直接刺激CD4+T細胞群體產生Treg?故本研究的目的一是探索DCs是否可直接從CD4+群體中產生Treg,哪種類型DCs(同種同型與同種異型、未成熟與成熟)作用最強,機制如何?進而建立簡便、價廉的產生Treg的方法,推動Treg的臨床應用。 DCs在體內分化、成熟和發(fā)揮作用時常常處于不同的微環(huán)境,氧壓是微環(huán)境中的重要因素。生理或病理情況下組織細胞經常處于不同氧壓的微環(huán)境,如在動脈栓塞、器官移植過程中,早期局部組織是處于一種遠遠低于大氣氧壓的低氧或乏氧狀態(tài)。當外界因素撤除或手術致使原本處于低氧狀態(tài)的組織血流通暢,氧供隨之恢復,即發(fā)生再氧合。這種乏氧-再氧合的病理生理過程,經常見于缺血再灌注損傷。那么不同氧壓對DCs的分化成熟及功能有何影響?不同氧壓微環(huán)境中產生的DCs對T細胞分化特別是對Treg分化有何影響?目前都尚不清楚。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)乏氧可抑制DCs的表型成熟和對T細胞的刺激功能。故本課題的目的二是在前期研究的基礎上,進一步研究乏氧-再氧合條件下小鼠DCs表型及功能變化,分析再氧合DCs對Th細胞及調節(jié)性T細胞的分化影響,并對其內在分子機制進行探討。這為解釋缺血再灌注損傷的發(fā)病機制,控制器官移植的排斥反應以及腫瘤免疫治療奠定一定的基礎。 總之,本課題包括兩部分內容：一、同種異型DCs在調節(jié)性T細胞產生中的作用及其機制研究；二、再氧合DCs在調節(jié)性T細胞產生中的作用及其機制研究。 第一部分同種異型DCs在調節(jié)性T細胞產生中的作用及其機制研究 方法 一、小鼠骨髓來源DCs的誘導 1.分離C57BL／6或BALB／c小鼠的骨髓細胞,利用細胞因子GM-CSF和IL-4誘導BM-DCs。 2.隔2天半量換液,第6天時給予LPS(1μg／ml)刺激24h,以誘導成熟。 二、自體DCs或同種異型DCs刺激CD4+T細胞產生Treg的能力 1.用免疫磁珠分離純化BALB／c小鼠脾臟CD4+T細胞,分別與自體(同基因型)DCs或同種異型DCs共培養(yǎng)。 2.流式細胞術(FCM)檢測培養(yǎng)體系中CD4+CD25+Treg的比例。 三、人外周血單個核細胞來源的DCs刺激CD4+T細胞產生Treg的能力 1.獲取不同人外周血10-15m1,分離單個核細胞(PBMC)。 2.免疫磁珠法分離CD4+T細胞。 3.PBMC靜置2h后去除未貼壁細胞,給予重組人GM-CSF和IL-4誘導成DCs。 4.將不同人的CD4+T細胞與DCs做同種異型或自體的細胞共培養(yǎng)。 5.流式細胞術(FCM)檢測培養(yǎng)體系中CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例。 四、增殖抑制試驗檢測CD4+CD25+Treg的抑制功能 1.將第一步中同種異型混合淋巴細胞培養(yǎng)產生的Treg (generated Treg)純化后作為抑制細胞,同種異型DCs作為刺激細胞,標記了CFSE的CD4+CD25-T細胞作為反應細胞,反應細胞：抑制細胞按照不同比例共培養(yǎng)。 2.新鮮分離的天然Treg作為實驗陽性對照,流式檢測反應細胞的增殖情況。 五、細胞因子在CD4+CD25+Treg產生中的作用 (一)探索IL-2在同種異型DCs刺激Treg產生中的作用 1.分離小鼠脾臟CD4+CD25+T細胞,標記CFSE,與同種異型DCs共培養(yǎng),并給予IL-2刺激,5天后FCM檢測同種異型DCs對CD4+CD25+T細胞的增殖情況。 2.分離CD4+CD25+T細胞,標記CFSE,然后與CD4+CD25-T細胞按照原來比例混合成CD4+T細胞整體,與同種異型DCs共培養(yǎng),培養(yǎng)5天后收集上清,ELISA檢測IL-2的水平。 3.IL-2阻斷試驗：上述體系中加入抗IL-2的中和性抗體,對照組加入同型對照IgG,5天后流式檢測CD4+CD25+T細胞的增殖情況。 (二)探索TGF-p在同種異型DCs刺激Treg產生中的作用 1.分離小鼠脾臟CD4+CD25-T細胞,標記CFSE,與同種異型DCs共培養(yǎng),不同時間后流式檢測Foxp3的表達和CFSE的情況。 2.收集不同時間的上清,ELISA檢測TGF-p水平。 3.TGF-p阻斷試驗：上述體系中加入不同濃度的TGF-p受體Ⅰ激酶抑制劑Ⅱ(ALK-5抑制劑Ⅱ),培養(yǎng)5天后檢測Foxp3的表達。 結果 一、在無外源性細胞因子存在的情況下,小鼠同種異型DCs可刺激CD4+T細胞高效產生Treg,但自體DCs無此作用 新鮮純化的CD4+T細胞純度大于95%,其中CD4+CD25+Foxp3+T細胞的比例小于10%。自體BM-DCs與抗CD3抗體聯(lián)合刺激CD4+T細胞3-5天后,T細胞大量活化,CD4+CD25+T細胞的比例明顯增加(90%),但其中Foxp3+T細胞的比例仍然小于10%。然而,用同種異型BM-DCs刺激CD4+T細胞后,盡管活化的CD4+CD25+T細胞的比例較自體DCs刺激體系低(50%-70%),然而其中Foxp3+T細胞的比例高達80%以上。隨著培養(yǎng)時間的延長,體系中CD4+CD25+Foxp3+T細胞的比例增加5-7倍。值得注意的是,未成熟同種異型DCs和成熟同種異型DCs刺激CD4+T細胞產生Treg的能力無明顯差異。 二、人同種異型DCs在沒有外源性細胞因子的情況下,同樣可以增加CD4+T細胞中Treg的比例 為了進一步證明同種異型DCs刺激Treg產生的能力,我們從人PBMC中用重組人GM-CSF和IL-4分別誘導同種異型或自體DCs,與CD4+T細胞共培養(yǎng),流式檢測體系中CD4+CD25+Foxp3+Treg的比例。結果顯示,自體DCs活化的CD4+CD25+T細胞中Foxp3+細胞表達在10%左右,而同種異型DCs活化的CD4+CD25+T細胞中Foxp3+Treg的比例高達40%左右,其作用與小鼠的同種異型DCs相似。 三、同種異型DCs產生的Treg在體外具有抑制功能 為了進一步證明同種異型DCs刺激產生的Treg (generated Treg)在體外是否保持其特有的抑制功能,我們將小鼠同種異型DCs刺激產生的CD4+CD25+T細胞純化后作為抑制細胞,按照不同比例與反應細胞CD4+CD25-T細胞共培養(yǎng),一定時間后流式檢測反應細胞的增殖情況,結果發(fā)現(xiàn),同種異型DCs刺激產生的Treg在體外具有明顯的抑制功能,與新鮮分離的nTreg一致。 四、內源性IL-2和TGF-β在同種異型DCs刺激CD4+T細胞產生Treg中發(fā)揮重要作用 為了探討同種異型DCs刺激CD4+T細胞高效產生Treg的機制,我們進一步研究了內源性IL-2和TGF-β在同種異型DCs刺激CD4+T細胞產生Treg中的作用。 1.IL-2在同種異型DCs刺激Treg擴增中發(fā)揮重要作用 1)用CFSE標記和流式細胞術證明在外源性IL-2存在的情況下,DCs可以有效的擴增nTreg 分離純化CD4+CD25+T細胞后用CFSE標記,然后與同種異型BM-DCs共培養(yǎng),并給予外源性IL-2刺激,5天后流式檢測細胞增殖情況,發(fā)現(xiàn)同種異型DCs可以有效擴增CD4+T細胞中的nTreg。 2)用抗體阻斷的方法證明內源性的IL-2在同種異型DCs刺激Treg擴增中發(fā)揮重要作用 分離純化CD4+CD25+T細胞后用CFSE標記,然后與CD4+CD25-T細胞按照原有的比例混合,與同種異型BM-DCs共培養(yǎng),ELISA檢測上清中細胞因子IL-2的水平,發(fā)現(xiàn)同種異型DCs刺激組中IL-2的水平明顯高于對照組。為了進一步驗證體系中IL-2的作用,在如上體系中同時加入抗IL-2的中和抗體,5天后收集細胞,流式檢測細胞CFSE增殖情況,發(fā)現(xiàn)與對照組IgG相比,IL-2阻斷抗體可以明顯抑制CD4+T細胞群體中CD4+CD25+T細胞的增殖。這說明同種異型DCs對CD4+CD25+Treg的有效擴增依賴于體系中的內源性IL-2。 2.TGF-β在同種異型DCs誘導Treg產生中發(fā)揮重要作用 1)用CFSE標記和流式術證明同種異型DCs可以誘導Treg的產生 新鮮分離小鼠脾臟CD4+CD25-T細胞,用CFSE標記,然后與同種異型BM-DCs共培養(yǎng)不同時間后,收集細胞,流式檢測Foxp3的表達情況。結果顯示,第5天時,同種異型DCs刺激的CD4+CD25-T細胞與新鮮分離的CD4+CD25-T細胞相比,Foxp3+T細胞比例明顯增加。隨著培養(yǎng)時間的延長,Foxp3+T細胞比例逐漸增加。當培養(yǎng)到第13天時,Foxp3的表達達到第5天時的兩倍。這表明在沒有外源性TGF-p存在的情況下,同種異型DCs可以誘導CD4+CD25-T向CD4+CD25+Foxp3+T細胞轉化。 2)同種異型DCs刺激體系中存在內源性TGF-β的產生 收集培養(yǎng)不同時間的上清,ELISA檢測上清中TGF-p的水平,結果提示,培養(yǎng)到第5天時,總的TGF-p水平明顯增加。并隨著培養(yǎng)時間的延長,其水平逐漸升高。當培養(yǎng)第13天時,TGF-β水平達到第5天時的2-3倍。 3)用抑制劑阻斷的方法證明內源性TGF-β在同種異型DCs刺激Treg產生中發(fā)揮重要作用 為進一步驗證產生的TGF-p在CD4+CD25+Foxp3+T細胞誘導中的作用,我們在如上體系中加入不同濃度的TGF-p受體Ⅰ激酶抑制劑Ⅱ(ALK-5抑制劑Ⅱ),定時間后,流式檢測Foxp3的表達。結果顯示,體系中CD4+Foxp3high T細胞的百分比和絕對數(shù)隨著ALK-5抑制劑Ⅱ濃度的增加而逐漸降低,且CD4+Foxp3dim T細胞的百分比和絕對數(shù)顯著下降,與加入的ALK-5抑制劑Ⅱ濃度具有明顯的劑量依賴關系。所以我們推測CD4+Foxp3dim T細胞可能是轉化的Foxp3+T細胞的潛在群體,且TGF-p在轉化過程中發(fā)揮著重要的作用。 結論 1.小鼠同種異型BM-DCs和人PBMC誘導的同種異型DCs,在無外源性細胞因子的情況下,都可以增加CD4+T細胞中Treg的比例,產生的Treg在體外對T細胞增殖具有抑制功能。 2.同種異型BM-DCs刺激的體系中,內源性IL-2和TGF-p在Treg的產生中發(fā)揮著重要的作用。 創(chuàng)新性和意義 1.首次發(fā)現(xiàn)同種異型BM-DCs在沒有外源性細胞因子的情況下可以刺激CD4+T細胞高效產生Treg,并探討了其機制。 2.首次將CD4+T細胞作為一個整體來尋找獲得足夠數(shù)量Treg的方法,為優(yōu)化后續(xù)研究的實驗方法、制定Treg的臨床治療策略提供了一定的理論依據。 研究的局限性 1.同種異型BM-DCs刺激CD4+T細胞產生Treg的具體內在分子調控機制有待于進一步深入研究。 2.所獲得Treg應用于臨床,其條件仍需進一步優(yōu)化。 第二部分再氧合DCs在調節(jié)性T細胞產生中的作用及其機制研究 方法 一、再氧合對DCs的表型影響 1.分離C57BL／6小鼠骨髓細胞,分別在常、乏氧條件下利用GM-CSF和IL-4誘導DCs,并給予LPS刺激。 2.對乏氧條件下分化的DCs進行再氧合不同時間。 3.流式檢測再氧合DCs表面協(xié)同刺激分子及MHC-Ⅱ類分子的表達。 二、再氧合對DCs的Th細胞增殖、分化的影響 1.分離CD4+T細胞并標記CFSE,與再氧合的同種異型DCs或自體DCs共培養(yǎng),后者給予抗CD3抗體刺激。 2.流式檢測再氧合DCs刺激CD4+T細胞增殖的能力。 3.收集細胞,流式檢測再氧合DCs刺激CD4+T細胞的分化情況。 三、再氧合影響DCs表型及功能的分子機制研究 1.將乏氧下分化的DCs進行再氧合,Real time PCR的方法檢測其表達四種腺苷受體的mRNA水平。 2.以不同腺苷受體激動劑處理再氧合的DCs,流式檢測其表型的變化。 3.流式檢測不同濃度A2AR腺苷受體激動劑對再氧合的DCs表型的影響。 4.ELISA檢測A2AR激動劑對再氧合DCs的細胞因子表達的影響。 結果 一、再氧合可逆轉乏氧對DCs成熟表型的抑制 為了研究再氧合對DCs表型的影響,我們在乏氧條件下誘導DCs后對其進行再氧合不同時間,流式檢測細胞表面分子的表達。結果顯示乏氧抑制DCs協(xié)同刺激分子CD80、CD86以及MHC-Ⅱ類分子的表達。再氧合6小時后其表達百分比和熒光強度均明顯上調,且熒光強度隨再氧合時間的延長而逐漸增加,再氧合24h、48h可達到高峰。這提示再氧合可以逆轉乏氧對DCs表型的抑制,促進DCs向成熟方向分化。 二、再氧合DCs刺激CD4+T細胞增殖的能力較乏氧DCs明顯增強 無論是在同種異型混合淋巴細胞反應體系中,還是在CD3單抗刺激的體系中,乏氧DCs刺激CD4+T細胞增殖的能力與常氧DCs相比非常弱。再氧合后,其誘導CD4+T細胞增殖的能力明顯提高。這提示無論針對同種異型抗原,還是自體抗原,再氧合DCs均具有很強的抗原遞呈功能。 三、再氧合DCs降低Treg的數(shù)量而上調Th17和Thl細胞應答 進一步我們檢測了同種異型混合淋巴細胞反應體系中,再氧合的DCs對CD4+T細胞分化的影響。結果顯示,再氧合DCs誘導產生的CD4+CD25+Foxp3+Tregs,與常氧成熟和未成熟DCs相比,明顯減少；相反,再氧合DCs可顯著誘導CD4+T細胞向IL-17+Th17細胞分化,其比例明顯高于未成熟DCs,甚至常氧成熟DCs刺激產生的IL-17+Th17細胞。同時,IFN-γ+Th1細胞的比例和上清中IFN-γ的水平也明顯高于常氧成熟和未成熟DCs刺激組。我們進一步研究了再氧合DCs的細胞因子分泌情況。結果證實再氧合24h的DCs上清中IL-6水平顯著升高,而TGF-p的水平則與乏氧組相比明顯降低。這提示再氧合DCs分泌的細胞因子更有利于使CD4+T細胞向Th17方向分化。總之,這些結果表明再氧合DCs具有很強的驅動Th17和Thl細胞介導的炎性反應的能力。 四、腺苷-A2AR通路在DCs乏氧-再氧合過程中發(fā)揮著重要的作用 1.再氧合可上調腺苷受體A2AR在DCs的表達,而對A1R、A2BR及A3R的表達無明顯影響 為了研究腺苷通路是否參與乏氧-再氧合對DCs表型和功能的影響,我們首先采用Real time PCR方法檢測了再氧合DCs的四種腺苷受體的mRNA表達水平,結果顯示,與常氧及乏氧DCs相比,再氧合DCs表達的A2AR水平呈現(xiàn)明顯升高趨勢；而各組之間A1R、A2BR及A3R的表達則無明顯變化。 2.A2AR受體激動劑可抑制再氧合DCs成熟相關表型的上調 為了進一步確認腺苷通路在乏氧-再氧合對DCs表型和功能的影響,我們在將乏氧下分化的DCs進行再氧合時,給予不同腺苷受體激動劑刺激,流式檢測DCs的表型。篩選結果提示,與對照組(再氧合組)相比,A2AR受體選擇性激動劑CGS21680可以抑制再氧合對乏氧DCs表型的上調作用,即抑制MHC-Ⅱ和協(xié)同刺激CD80、CD86的表達。而A1R、A2BR、A3R的激動劑則沒有此功能。 3.A2AR激動劑對再氧合DCs表型的抑制具有濃度依賴性 體外進一步檢測了不同濃度的A2AR受體選擇性激動劑CGS21680對再氧合DCs表型的影響。流式結果顯示,隨著CGS21680濃度的增加,協(xié)同刺激分子CD80、CD86及MHC-Ⅱ表達的平均熒光強度逐漸降低,與對照組相比有顯著性差異,這進一步提示A2AR通路確實在DCs的乏氧-再氧合過程中發(fā)揮著重要的作用。 4.A2AR激動劑可明顯抑制再氧合DCs促炎細胞因子產生,而上調抑炎細胞因子產生 我們進一步檢測了不同腺苷受體激動劑對再氧合DCs的細胞因子分泌情況,ELISA結果顯示A2AR選擇性激動劑CGS21680可以明顯抑制再氧合DCs炎性細胞因子IL-1p、IL-6和TNF-a等的分泌,而上調其免疫抑制因子TGF-p的分泌。這說明腺苷受體通路參與再氧合逆轉乏氧對DCs功能的影響,A2AR受體通路可能是再氧合上調DCs表型和功能的一個重要調節(jié)分子。 結論 一、再氧合可以逆轉乏氧對DCs成熟表型及功能的抑制作用 1.再氧合可明顯促進乏氧下分化DCs的表型成熟。 2.再氧合可明顯促進DCs對同種異型及同種同型抗原的遞呈功能,明顯增強DCs對CD4+T細胞增殖的能力,可降低Treg的數(shù)量而促進CD4+T細胞向Th17和Th1方向分化。 二、腺苷受體通路參與再氧合逆轉乏氧對DCs表型及功能的影響 1.再氧合DCs表達高水平腺苷受體A2AR。 2.A2AR激動劑CGS21680抑制再氧合逆轉乏氧對DCs表型的能力,并具有濃度依賴性。 3.A2AR激動劑CGS21680抑制再氧合DCs炎性細胞因子的表達。 創(chuàng)新性和意義 1.首次發(fā)現(xiàn)再氧合可明顯逆轉乏氧對DCs的成熟表型及功能的影響,這為解釋缺血再灌注損傷的發(fā)病機制提供有力的證據,證明乏氧-再氧合可能是導致缺血再灌注損傷的內在機制之一。 2.首次發(fā)現(xiàn)A2AR腺苷受體通路抑制再氧合對乏氧DCs表型及功能的逆轉作用,為尋找從免疫學角度治療缺血再灌注損傷的新策略提供新思路。 研究的局限性 1.腺苷通路參與再氧合促進乏氧DCs表型及功能成熟的內在分子機制仍需進一步研究。 2.腺苷受體激動劑應用于治療IRI的體內實驗有待于進一步補充。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R392

【參考文獻】

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1 Ori Rotstein;;Toll-like receptor 4 involvement in hepatic ischemia/reperfusion injury in mice[J];Hepatobiliary & Pancreatic Diseases International;2004年02期

2 ;Role of adhesion molecules and dendritic cells in rat hepatic/renal ischemia-reperfusion injury and anti-adhesive intervention with anti-P-selectin lectin-EGF domain monoclonal antibody[J];World Journal of Gastroenterology;2005年07期

本文編號：2665306