【摘要】： 一、研究背景和目的 淋巴瘤病理學(xué)診斷是臨床病理診斷工作中的主要難題之一，迫切需要其它技術(shù)來協(xié)助，如免疫組化技術(shù)和基因重排檢測(cè)技術(shù)等。自McCarthy將PCR技術(shù)用于檢測(cè)抗原受體基因重排輔助診斷淋巴瘤以來，一直受到人們的關(guān)注。然而，假陰性率高、結(jié)果不穩(wěn)定等因素嚴(yán)重阻礙著該技術(shù)的廣泛應(yīng)用，在石蠟組織中尤其如此。隨著分子生物技術(shù)的發(fā)展和人類基因組測(cè)序工作的完成，將該技術(shù)進(jìn)一步完善并及早運(yùn)用于臨床已勢(shì)在必行。出于此目的，本研究以石蠟組織為主要研究對(duì)象，從免疫球蛋白(Ig)基因重排引物分析和設(shè)計(jì)、引物條件的摸索、石蠟包埋組織DNA的提取、引物在淋巴瘤石蠟組織中的重排測(cè)定比較等諸方面，對(duì)Ig基因重排PCR檢測(cè)的條件進(jìn)行了優(yōu)化和探索。 二、方法 1．①用Clustal W軟件，將常用的15余對(duì)用于Ig重鏈和輕鏈基因重排檢測(cè)的引物與免疫球蛋白基因組中相應(yīng)區(qū)域基因片段進(jìn)行比較和分析。②用Primer Premier5.0軟件對(duì)引物結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析和優(yōu)化。 2．①通過檢測(cè)DG75和Jurkat淋巴瘤細(xì)胞的基因重排，將15對(duì)引物的條件進(jìn)行優(yōu)化和選擇。②對(duì)PCR重排產(chǎn)物進(jìn)行了測(cè)序和分析。 3．用21例淋巴相關(guān)石蠟組織，通過測(cè)定DNA含量和觀察PCR結(jié)果等方法，比較了消化法、酚抽提法和試劑盒法對(duì)石蠟組織DNA提取效果。 第一軍醫(yī)大學(xué) 齊宗利 4.用8對(duì)(I 97對(duì)和TC助1對(duì))基因重排引物，對(duì)144例(B淋巴瘤 113例、T淋巴瘤24例、淋巴結(jié)反應(yīng)性增生7例)石蠟組織的基因重排 進(jìn)行了檢測(cè)。 三、結(jié)果 1.①通過比較巧對(duì)引物，設(shè)計(jì)出4對(duì)新的Ig基因重排引物(P2、 PZB、P、和P勸。②Primer Pre而er軟件結(jié)果認(rèn)為結(jié)構(gòu)較為合理。 2.①優(yōu)化篩選出s對(duì)(197對(duì)和TCRI對(duì))引物。②用IgH FR3區(qū) 基因重排引物測(cè)定DG75細(xì)胞基因重排，可擴(kuò)增出3條清晰條帶，經(jīng)測(cè) 序證實(shí)，第一條帶為目的帶，其它兩條均與免疫球蛋白序列有關(guān):③已 經(jīng)向GeneBank遞交了5個(gè)基因序列，最早遞交的P3一SFA (v26一oL4一1 14bp)己經(jīng)公布，其它序列正在處理之中。 3.①從模板oD26夕OD28。比值和穩(wěn)定程度上看，試劑盒法提取的 DNA質(zhì)量要略優(yōu)于酚抽提法和消化法;②從用PcR擴(kuò)增看家p一globin 基因片段的結(jié)果來看，這幾種方法差別不大。 4.①在49例B細(xì)胞淋巴瘤石蠟組織中，引物對(duì)Pl(F R3區(qū)引物)、 PZA(FR2區(qū)引物)、Plc(F Rl區(qū)引物)的檢出率分別為71.4%、61.2%和 36.70，0，Ple檢出率明顯低于PI和 PZA。②rR3區(qū)的引物對(duì)(P一、PZ、P3) 對(duì)113例B細(xì)胞淋巴瘤的陽性檢出率分別為71.7%、82.3%、76.1%，三 者之間檢出率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中，我們自己設(shè)計(jì)的引物對(duì)P2檢出率最 高。③Ig輕鏈的引物(PK+P勸在39例B細(xì)胞淋巴瘤的檢出率為71.8%， ④經(jīng)測(cè)定結(jié)果的分析、組合和比較，優(yōu)選出一對(duì)最佳引物對(duì)一(P1+P2)， 使B細(xì)胞淋巴瘤石蠟組織重排的檢出率由82.3%提高到92.9%。 四、結(jié)論 本研究設(shè)從引物分析入手，設(shè)計(jì)出4對(duì)用于免疫球蛋白基因重排的 引物(重鏈為P2和PZB，輕鏈為PK和P勸。通過淋巴瘤細(xì)胞和石蠟組 織基因重排的檢測(cè)，得出如下有意義的結(jié)論: 1.石蠟組織基因重排檢測(cè)中，IgH不同框架區(qū)的引物檢出率明顯不 同，IgH FR3區(qū)引物明顯高于FRI區(qū)和FRZ區(qū)引物。 2.與其它常用引物相比，我們新設(shè)計(jì)的IgH FR3區(qū)引物對(duì)(pZ)在1 13 一2- 博士研究生學(xué)位論文 例B細(xì)胞淋巴瘤檢出率最高，，為82.3%。 3.(P1+P2)引物的組合，可使B細(xì)胞淋巴瘤石蠟組織基因重排的 檢出率提高到92.9%。 4.在石蠟組織DNA的提取方法中，消化法安全、簡(jiǎn)單、實(shí)用，只 要DNA濃度適量，可以取得與其它石蠟包埋組織DNA提取方法同樣的 效果。
【圖文】：

犯O乃O，125眾的黔圖2一2引物濃度對(duì)基因重排影響的2%瓊脂糖電泳結(jié)果(單位:mM)三、IgH重排引物對(duì)DG75細(xì)胞重排溫度梯度檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行溫度梯度PCR時(shí)，首先按照表2一1中的程序進(jìn)行，如果只有某一側(cè)部出現(xiàn)條帶(左側(cè)或右側(cè))，可根據(jù)情況，適當(dāng)對(duì)預(yù)設(shè)的退火溫度進(jìn)行調(diào)整。各引物的最佳退火溫度見表2一2。表2一219重鏈重排引物的最適退火溫度PrimerforIgHannealingT(aC)Band(bp)Ple(FRle一JH18)61.0330一350PZA(FRZA一川18)59.0250一270PZB(FRZB一爪18)60.0250一270PI(FR3一川)58.080一120PZ(FR33一爪3)61.080一120P3(V26一OL4)58.080一120一41-

博士研究生學(xué)位論文缺12.的存自的3，傭1501，13眾書03名眾的圖2一1不同Mg2+濃度對(duì)重排檢測(cè)影響的2%瓊脂糖電泳結(jié)果(單位:卿)(注:M為100一600飾ladderMarker，以下同)二、引物濃度對(duì)基因重排結(jié)果的影響以FR3一m為引物，DG75為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果引物濃度在0.2一0.SInM之間最佳。帶丫粵勢(shì)參爪拼.性一0，犯O乃O，125眾的黔圖2一2引物濃度對(duì)基因重排影響的2%瓊脂糖電泳結(jié)果(單位:mM)三、IgH重排引物對(duì)DG75細(xì)胞重排溫度梯度檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行溫度梯度PCR時(shí)，首先按照表2一1中的程序進(jìn)行，如果只有某一側(cè)部出現(xiàn)條帶(左側(cè)或右側(cè))
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R361

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前7條

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7 劉永

本文編號(hào)：2664718