【摘要】： 本實(shí)驗(yàn)是在中國人類基因組南方研究中心2001年10月份完成我國境內(nèi)問號鉤端螺旋體黃疸出血群賴型賴株#56601(Leptospira interrogans serogroup Icterohaemorrhagiae serovar lai type strain #56601)(強(qiáng)毒株)全基因組測序的基礎(chǔ)上開展的。在部分參與基因注釋過程中，發(fā)現(xiàn)一系列和致病相關(guān)的基因，如黏附和侵襲相關(guān)基因、鞭毛基因、運(yùn)動／趨化相關(guān)基因、LPS合成相關(guān)基因、信號傳導(dǎo)基因、與溶血、貧血、黃疸相關(guān)的溶血素基因、與出血相關(guān)基因、調(diào)節(jié)菌體生長狀態(tài)的凋亡基因等等。致病性鉤端螺旋體全基因組所揭示的獨(dú)特的生理學(xué)和病理學(xué)特征發(fā)表在2003年4月24日出版的Nature雜志，其中與溶血、出血、菌體凋亡相關(guān)的部分基因功能的研究結(jié)果來自本實(shí)驗(yàn)。 鉤端螺旋體(Leptospira)是一種呈細(xì)長絲狀、圓柱形、螺旋盤繞規(guī)則而致密的螺旋體，它需氧、運(yùn)動活潑，是一種既能在體內(nèi)生長、又能在體外培養(yǎng)的微生物，在世界范圍引起人獸共患病—鉤端螺旋體病。其體外生長受到很多因素的影響。較適宜的培養(yǎng)基為EMJH和Korthof培養(yǎng)基，但生長緩慢(需40～50個(gè)小時(shí)達(dá)到對數(shù)期)，菌濃低。幼齡豚鼠感染實(shí)驗(yàn)證明：體外培養(yǎng)的有毒株仍然具有強(qiáng)致病性，無毒株無致病力，兩者在毒力方面有顯著差別。 利用生物信息學(xué)手段首次預(yù)測鉤端螺旋體染色體共編碼了十個(gè)溶血素基因，其中九個(gè)未知，分為兩大類，即鞘磷脂酶類(LA1027，LA1029，LA3050，LA4004)和非鞘磷脂酶類(LA0327，LA0378，LA1650，LA3937，LA0150)。在原核系統(tǒng)中克隆、表達(dá)并純化了其中八個(gè)溶血素基因，血平板“熱-冷孵育”法鑒定了這些蛋白的溶血功能。薄層層析法和高效液相色譜法進(jìn)一步鑒定LA1027，LA1029，LA3050和LA4004的鞘磷脂酶活性。如此眾多的溶血素基因同時(shí)編碼于同一個(gè)染色體上，這在微生物界是首次發(fā)現(xiàn)。 RT-PCR實(shí)驗(yàn)證明溶血素基因在鉤端螺旋體中都轉(zhuǎn)錄；Western-blot實(shí)驗(yàn)證明在EMJH環(huán)境下，大多數(shù)溶血素基因都表達(dá)(LA1027不表達(dá)，LA3050只在有毒株中表達(dá))，而且和毒性無關(guān)；ELISA實(shí)驗(yàn)證實(shí)多數(shù)溶血素蛋白均能被分泌到菌體外，分泌量和毒力相關(guān)(其中LA1027和LA0378幾乎為零)。 鉤端螺旋體鞘磷脂酶類溶血素LA1029和非鞘磷脂酶類溶血素LA3937均對細(xì)胞有顯著的毒性作用，致使細(xì)胞絨毛消失，細(xì)胞膜破裂或完全消失，胞質(zhì)外漏，胞槳染色變淺，細(xì)胞器腫大、外溢、丟失，細(xì)胞核出現(xiàn)空泡，細(xì)胞染色質(zhì)凝集，甚至核膜邊緣不整齊，有破裂，細(xì)胞壞死現(xiàn)象嚴(yán)重。大量的細(xì)胞碎片黏附在為數(shù)不多的完整細(xì)胞表面。部分肝細(xì)胞出現(xiàn)典型的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，如線粒體腫大，細(xì) 沈陽藥科大學(xué)博仁學(xué)位論文 摘要 胞核邊聚、濃縮、有多個(gè)核結(jié)構(gòu)，裂解為核小體。流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)LA 1 029 能誘發(fā)14.73%一57.92%的肝細(xì)胞發(fā)生凋亡，，但是不能誘發(fā)腎細(xì)胞293凋亡; LA3937能引發(fā)腎細(xì)胞周期改變。人cDNA array結(jié)果表明LA1029能顯著改變肝 細(xì)胞的表達(dá)譜，其中90個(gè)基因的表達(dá)發(fā)生顯著變化，上調(diào)基因10個(gè)，下調(diào)基因 80個(gè)，這些基因主要分布在與腫瘤發(fā)生、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、代 謝、蛋白質(zhì)合成等方面，說明 LA 1 029能引起組織細(xì)胞的多種病理改變。此外， 溶血素LA 1 029能刺激細(xì)胞分泌炎癥介導(dǎo)因子IL一lp和IL一6。說明鉤端螺旋體溶 血素即能引起嚴(yán)重的細(xì)胞壞死，也能引起細(xì)胞凋亡，和鉤體病患者的組織器官炎 性反應(yīng)、發(fā)熱、功能障礙、衰竭有直接關(guān)系。 鉤端螺旋體染色體還編碼一套可能和出血病癥相關(guān)的基因，包括1個(gè)溶菌酶 基因(acm)，1個(gè)膠原酶基因(colA)，17個(gè)Yer6’inia YopM蛋白基因(，勿，卿、 l個(gè)血小板激活因子乙酞化酶基因切曠ah)、2個(gè)類似于von Willebrand faetorA domain的基因(vwA了，v砂月2)。這些基因除了vwAZ之外均轉(zhuǎn)錄，由此推測構(gòu)建 一副出血模型圖。 以牛腦胞內(nèi)PAF一AHI型蛋白Y亞基1認(rèn)AB(PDB數(shù)據(jù)庫編號)為模件，計(jì) 算機(jī)模擬出鉤端螺旋體隊(duì)F一AH(LAZ 144)蛋白的立體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)它們極其相似， 酶催化位點(diǎn)(ser“’一Hisz08一Asp20，)保守。檢測菌體和培養(yǎng)上清液中隊(duì)F一AH酶活 性，發(fā)現(xiàn)其不分泌到細(xì)胞外，可能是一種胞內(nèi)酶。Westom一blot顯示隊(duì)F一AH表 達(dá)量與毒性相關(guān)�？寺　⒈磉_(dá)并純化重組蛋白PAF一AH，發(fā)現(xiàn)其米氏常數(shù)Km同 正常人血清Km，血小板凝集實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明重組PAF一AH具有阻止血小板聚集 的生物學(xué)活性。比較血清隊(duì)F一AH酶活性，發(fā)現(xiàn)黃疽出血群患者酶活性顯著高于 正常人和其他型鉤體病患者，推測這可能是由于毒力株黃疽出血群鉤體釋放了大 量PAF一AH到人體血液系統(tǒng)中，滅活宿主體內(nèi)血小板激活因子(PAF)的生理活 性，使血小板不能勤附、聚集到毛細(xì)血管微小受損處，不能分泌眾多凝血因子， 從而妨礙宿主的止血及凝血，導(dǎo)致大出血癥狀，是鉤端螺旋體出血癥狀的重要致 病因子之一。 比較基因組分析，發(fā)現(xiàn)鉤端螺旋體編碼了一對緊密聯(lián)系的基因座vopBc loci， 該基因與其他微生物中的同類基因在氨基酸序列和操縱子結(jié)構(gòu)上相似。在大腸桿 菌表達(dá)系統(tǒng)中單獨(dú)表達(dá)v即刀、vopc基因，發(fā)現(xiàn)vopC基因產(chǎn)物抑制菌體的生長， 同時(shí)表達(dá)vaPB和vaPc基因時(shí)，菌體生長正常。這種現(xiàn)象與現(xiàn)
【圖文】：

20%一30%鞘磷脂成分，它們可以被鞘磷脂酶水解而發(fā)生溶血，因此上述蛋白被命名為鞘磷脂酶類溶血素。將己知的鞘磷脂酶溶血素SP17627和預(yù)測的鞘磷脂酶溶血素結(jié)構(gòu)域種類、分布進(jìn)行比較，結(jié)果見圖1一8。同時(shí)比較上述蛋白在結(jié)構(gòu)域內(nèi)的氨基酸序列相似性，結(jié)果見表1一4。0100200300400500卜釗.一叫叫訓(xùn)叫喇呻材州咐悶材一叫引引喇.一婦喇中一叫喇叫喇喇中P17627556aa鞘磷脂酶類濟(jì)血素各結(jié)構(gòu)域功能說明F19.1一呂Domaint’UnetionalanalysisofPutativesPh一ngomyelinase一likehemolysin圖1一8預(yù)測的鞘磷脂酶類溶血素蛋白結(jié)構(gòu)域分析表1一4鞘磷脂酶類溶血素與5P17627在各結(jié)構(gòu)域相似性比較(相同性，相似性，%)GenCIDP17627LA1027PD133144PD011673PD447657PD041204100，100100，10061，76100，10071，78100

使用PCR方法從鉤端螺旋體賴株染色體上擴(kuò)增溶血素基因的相應(yīng)片段，PCR引物、擴(kuò)增體系以及擴(kuò)增反應(yīng)程度見實(shí)驗(yàn)方法。溶血素?cái)U(kuò)增片段的大小以及重組表達(dá)的蛋白分子量、PI等信息見表1一5，PCR擴(kuò)增結(jié)果見圖1一16。將擴(kuò)增成功的基因片段進(jìn)行DNA測序，確定它們與原基因組序列一致后，按照實(shí)驗(yàn)方法操作，將其重組到質(zhì)粒pET28b(+)，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)pLys中進(jìn)行表達(dá)。表1一5No·oeneInpCRProduet(bP)體外克隆、表達(dá)溶血素重組蛋白的分子量a.a.net-PInet-M.W.his一Ihis一M.W.StabilityS

本文編號：2660914