【摘要】： 細胞惡變是一個非常復雜且受多種因素影響的過程，除了EB病毒感染外，鼻咽癌的發(fā)生還與遺傳因素、環(huán)境因素以及生活習慣等有關。隨著研究的深入，EB病毒在NPC發(fā)生、發(fā)展中的作用日益受到重視。 EB病毒感染的宿主范圍極其狹窄，僅能感染人及少數(shù)幾種靈長類動物。病毒感染的靶細胞主要有兩種：B淋巴細胞和復層鱗狀上皮細胞，B細胞源性腫瘤如伯基特氏淋巴瘤和免疫母細胞性淋巴瘤、上皮細胞源性腫瘤如鼻咽癌均與EBV感染密切相關。EBV感染B淋巴細胞的途徑已十分清楚，B細胞表面存在EB病毒受體CR2，CR2原為補體C3d的受體，因EB病毒主要殼膜糖蛋白gp350/220的分子結(jié)構與C3d高度相似，故可經(jīng)過該受體進入細胞。 EB病毒如何進入上皮細胞，其機制至今未明，可能通過以下途徑：(1)通過與上皮細胞表面的CR2受體結(jié)合；(2)作為免疫復合物的一部分進入被感染細胞；(3)通過產(chǎn)病毒細胞與上皮細胞間的直接接觸或與粘膜細胞融合而感染上皮細胞；(4)在輔助因子/輔受體的幫助下感染細胞，或在輔病毒的幫助下轉(zhuǎn)變?yōu)槟芨腥旧掀ぜ毎募傩汀?在研究EBV與NPC關系中最常遇到的問題就是，在體外培養(yǎng)過程中EBV不能直接感染人正常上皮細胞，更談不上轉(zhuǎn)化上皮細胞，從而構建出具有代表性的NPC細胞系。尋求建立EBV易感的適當細胞及整體動物模型一直是研究者們追求的方向。本研究在這方面進行了嘗試，借助于轉(zhuǎn)基因技術將病毒受體基因?qū)胄∈蟊茄什可掀ぜ毎�，以期能建立近似于自然感染EBV的小鼠動物模型，為研究EBV與NPC的關系奠定良好的 實驗動物基礎。 本文進行了如下研究: (一)轉(zhuǎn)基因載體的構建:PCR法擴增ED一L2啟動子，利用基因重 組技術，分別構建pEDLZ一hCRZ/PEDLZ一p工gR上皮特異性表達載體，經(jīng)限 制性內(nèi)切酶鑒定及測序證實獲得目的基因正向插入克隆; (二)轉(zhuǎn)基因載體體外轉(zhuǎn)染實驗及載體特異性分析:利用脂質(zhì)體法 分別將pEDLZ一hCRZ/pEDLZ一p工gR兩種載體轉(zhuǎn)染人表皮細胞HaCaT和小鼠 鼻咽上皮細胞TMNE，建立了穩(wěn)定表達上述兩種受體的克隆細胞，通過 RT一PCR和免疫組化方法證實目的基因在宿主細胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達水 平均正確。同時還瞬時轉(zhuǎn)染了人胚肺細胞Wl一38、人結(jié)腸腺癌細胞LOVO 和鼠成纖維細胞NIH3T3，目的基因在W工一38及NIH3T3細胞內(nèi)不表達， 在LOVO細胞內(nèi)的表達水平，與轉(zhuǎn)染空載體及空白對照細胞基本一致，提 示ED一L2啟動子在宿主細胞內(nèi)能正確調(diào)控目的基因的表達。 (三)體外病毒感染實驗:對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CRZ/plgR的HaCaT、TMNE細 胞，在體外培養(yǎng)過程中分別用EBV、EBV+TPA及T以處理，兩種受體陽性 細胞EBV/EBV+T以處理組均能感染上病毒，PCR及Southern Blot能檢 測到EBV BamHIW片段，EBER一1原位雜交陽性，感染率在18.96%一32.82 %之間，病毒對HaCaT細胞的感染率明顯高于TMNE細胞(P0.05)。電 鏡下在TMNE一CRZ/T MNE一plgR細胞內(nèi)均找到病毒顆粒，確證目的蛋白 CRZ/p工gR在鼠源性TMNE細胞內(nèi)也能正確發(fā)揮其生物學功能。轉(zhuǎn)染受體 的TMNE細胞在體外能感染上EB病毒，直接提示攜帶EB病毒相關受體的 轉(zhuǎn)基因鼠，其鼻咽部上皮是完全有可能感染上EB病毒的。 (四)CRZ/plgR轉(zhuǎn)基因小鼠的建立:將pEDLZ一hCRZ/pEDLZ一plgR載 體雙酶切后，僅保留啟動子+目的基因片段，通過顯微注射的方法，分別 注射入小鼠受精卵，注射后受精卵的成活率約40%~50%，，移入假孕母 鼠體內(nèi)，約6%左右的移植胚胎可以發(fā)育正常足月，產(chǎn)下CRZ、plgRFO 代鼠28、47只，PCR檢測分別有11、15只陽性，Southern Blot分析各 有4、6只鼠陽性，陽性率分別為14.28%、12.77%。plgR FO代southern 雜交陽性鼠雌雄交配或與正常鼠合籠，產(chǎn)下plgRFI代鼠71只，PCR檢 測23只陽性，Southern雜交7只陽性，陽性率為9.86%。分別處死 Southern雜交陽性CRZ FO及plgR FO/FI代轉(zhuǎn)基因鼠各1只，免疫組化 一6- 顯示目的蛋白在p工gRFO代轉(zhuǎn)基因鼠的鼻咽、食道上皮能正常表達，氣 管、胃、腸、腎等上皮無表達;但目的蛋白在CRZFO、plgRFI代鼠鼻 咽、食道和舌頭上皮無明確表達。對Southern Blot鑒定為陽性的鼠， 用EBV+TPA隔日滴鼻處理，最長時間達3個月，未能觀察到小鼠感染上 EBV，ELISA檢測轉(zhuǎn)基因鼠外周血EBV一IgG均呈陰性。 本實驗首次建立了鼻咽部特異性表達EB病毒受體的轉(zhuǎn)基因鼠，雖未 能觀察到動物感染上了EB病毒，但我們的實驗在EBV易感動物模型方面 進行了有益的嘗試，如能對實驗進行進一步的改進，也許在不久的將來 將會取得突破。
【圖文】：

pEDLZ質(zhì)粒構建示意圖

123質(zhì)粒分別經(jīng)EeoRI+Hindlll、產(chǎn)物條帶大小正確，見圖4、123—pLXSN—hCRZ圖4，pLxSN質(zhì)粒用EeoRI+Hindlll雙酶t)J鑒定1，pLXSN質(zhì)粒/EeoRI單酶切;2，Marker:入一DNA/Hindlll;3，pLXSN/EeoRI+Hindlll雙酶切一28-圖5，pLXSN一hCRZ質(zhì)粒用Hpal酶切鑒定l，pLXSN一hCRZ質(zhì)粒/Hindlll酶切;2，Marker:人一DNA/Hindlll;3
【學位授予單位】：中國人民解放軍第一軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R-332

【參考文獻】

相關期刊論文 前6條

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本文編號：2660520