【摘要】： 細(xì)胞惡變是一個非常復(fù)雜且受多種因素影響的過程，除了EB病毒感染外，鼻咽癌的發(fā)生還與遺傳因素、環(huán)境因素以及生活習(xí)慣等有關(guān)。隨著研究的深入，EB病毒在NPC發(fā)生、發(fā)展中的作用日益受到重視。 EB病毒感染的宿主范圍極其狹窄，僅能感染人及少數(shù)幾種靈長類動物。病毒感染的靶細(xì)胞主要有兩種：B淋巴細(xì)胞和復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞，B細(xì)胞源性腫瘤如伯基特氏淋巴瘤和免疫母細(xì)胞性淋巴瘤、上皮細(xì)胞源性腫瘤如鼻咽癌均與EBV感染密切相關(guān)。EBV感染B淋巴細(xì)胞的途徑已十分清楚，B細(xì)胞表面存在EB病毒受體CR2，CR2原為補(bǔ)體C3d的受體，因EB病毒主要?dú)つぬ堑鞍譯p350/220的分子結(jié)構(gòu)與C3d高度相似，故可經(jīng)過該受體進(jìn)入細(xì)胞。 EB病毒如何進(jìn)入上皮細(xì)胞，其機(jī)制至今未明，可能通過以下途徑：(1)通過與上皮細(xì)胞表面的CR2受體結(jié)合；(2)作為免疫復(fù)合物的一部分進(jìn)入被感染細(xì)胞；(3)通過產(chǎn)病毒細(xì)胞與上皮細(xì)胞間的直接接觸或與粘膜細(xì)胞融合而感染上皮細(xì)胞；(4)在輔助因子/輔受體的幫助下感染細(xì)胞，或在輔病毒的幫助下轉(zhuǎn)變?yōu)槟芨腥旧掀ぜ?xì)胞的假型。 在研究EBV與NPC關(guān)系中最常遇到的問題就是，在體外培養(yǎng)過程中EBV不能直接感染人正常上皮細(xì)胞，更談不上轉(zhuǎn)化上皮細(xì)胞，從而構(gòu)建出具有代表性的NPC細(xì)胞系。尋求建立EBV易感的適當(dāng)細(xì)胞及整體動物模型一直是研究者們追求的方向。本研究在這方面進(jìn)行了嘗試，借助于轉(zhuǎn)基因技術(shù)將病毒受體基因?qū)胄∈蟊茄什可掀ぜ?xì)胞，以期能建立近似于自然感染EBV的小鼠動物模型，為研究EBV與NPC的關(guān)系奠定良好的 實(shí)驗(yàn)動物基礎(chǔ)。 本文進(jìn)行了如下研究: (一)轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建:PCR法擴(kuò)增ED一L2啟動子，利用基因重 組技術(shù)，分別構(gòu)建pEDLZ一hCRZ/PEDLZ一p工gR上皮特異性表達(dá)載體，經(jīng)限 制性內(nèi)切酶鑒定及測序證實(shí)獲得目的基因正向插入克隆; (二)轉(zhuǎn)基因載體體外轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)及載體特異性分析:利用脂質(zhì)體法 分別將pEDLZ一hCRZ/pEDLZ一p工gR兩種載體轉(zhuǎn)染人表皮細(xì)胞HaCaT和小鼠 鼻咽上皮細(xì)胞TMNE，建立了穩(wěn)定表達(dá)上述兩種受體的克隆細(xì)胞，通過 RT一PCR和免疫組化方法證實(shí)目的基因在宿主細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)表達(dá)水 平均正確。同時還瞬時轉(zhuǎn)染了人胚肺細(xì)胞Wl一38、人結(jié)腸腺癌細(xì)胞LOVO 和鼠成纖維細(xì)胞NIH3T3，目的基因在W工一38及NIH3T3細(xì)胞內(nèi)不表達(dá)， 在LOVO細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平，與轉(zhuǎn)染空載體及空白對照細(xì)胞基本一致，提 示ED一L2啟動子在宿主細(xì)胞內(nèi)能正確調(diào)控目的基因的表達(dá)。 (三)體外病毒感染實(shí)驗(yàn):對穩(wěn)定轉(zhuǎn)染CRZ/plgR的HaCaT、TMNE細(xì) 胞，在體外培養(yǎng)過程中分別用EBV、EBV+TPA及T以處理，兩種受體陽性 細(xì)胞EBV/EBV+T以處理組均能感染上病毒，PCR及Southern Blot能檢 測到EBV BamHIW片段，EBER一1原位雜交陽性，感染率在18.96%一32.82 %之間，病毒對HaCaT細(xì)胞的感染率明顯高于TMNE細(xì)胞(P0.05)。電 鏡下在TMNE一CRZ/T MNE一plgR細(xì)胞內(nèi)均找到病毒顆粒，確證目的蛋白 CRZ/p工gR在鼠源性TMNE細(xì)胞內(nèi)也能正確發(fā)揮其生物學(xué)功能。轉(zhuǎn)染受體 的TMNE細(xì)胞在體外能感染上EB病毒，直接提示攜帶EB病毒相關(guān)受體的 轉(zhuǎn)基因鼠，其鼻咽部上皮是完全有可能感染上EB病毒的。 (四)CRZ/plgR轉(zhuǎn)基因小鼠的建立:將pEDLZ一hCRZ/pEDLZ一plgR載 體雙酶切后，僅保留啟動子+目的基因片段，通過顯微注射的方法，分別 注射入小鼠受精卵，注射后受精卵的成活率約40%~50%，，移入假孕母 鼠體內(nèi)，約6%左右的移植胚胎可以發(fā)育正常足月，產(chǎn)下CRZ、plgRFO 代鼠28、47只，PCR檢測分別有11、15只陽性，Southern Blot分析各 有4、6只鼠陽性，陽性率分別為14.28%、12.77%。plgR FO代southern 雜交陽性鼠雌雄交配或與正常鼠合籠，產(chǎn)下plgRFI代鼠71只，PCR檢 測23只陽性，Southern雜交7只陽性，陽性率為9.86%。分別處死 Southern雜交陽性CRZ FO及plgR FO/FI代轉(zhuǎn)基因鼠各1只，免疫組化 一6- 顯示目的蛋白在p工gRFO代轉(zhuǎn)基因鼠的鼻咽、食道上皮能正常表達(dá)，氣 管、胃、腸、腎等上皮無表達(dá);但目的蛋白在CRZFO、plgRFI代鼠鼻 咽、食道和舌頭上皮無明確表達(dá)。對Southern Blot鑒定為陽性的鼠， 用EBV+TPA隔日滴鼻處理，最長時間達(dá)3個月，未能觀察到小鼠感染上 EBV，ELISA檢測轉(zhuǎn)基因鼠外周血EBV一IgG均呈陰性。 本實(shí)驗(yàn)首次建立了鼻咽部特異性表達(dá)EB病毒受體的轉(zhuǎn)基因鼠，雖未 能觀察到動物感染上了EB病毒，但我們的實(shí)驗(yàn)在EBV易感動物模型方面 進(jìn)行了有益的嘗試，如能對實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的改進(jìn)，也許在不久的將來 將會取得突破。
【圖文】：

pEDLZ質(zhì)粒構(gòu)建示意圖

123質(zhì)粒分別經(jīng)EeoRI+Hindlll、產(chǎn)物條帶大小正確，見圖4、123—pLXSN—hCRZ圖4，pLxSN質(zhì)粒用EeoRI+Hindlll雙酶t)J鑒定1，pLXSN質(zhì)粒/EeoRI單酶切;2，Marker:入一DNA/Hindlll;3，pLXSN/EeoRI+Hindlll雙酶切一28-圖5，pLXSN一hCRZ質(zhì)粒用Hpal酶切鑒定l，pLXSN一hCRZ質(zhì)粒/Hindlll酶切;2，Marker:人一DNA/Hindlll;3
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍第一軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號】：R-332

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

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本文編號：2660520