【摘要】：1.研究目的：盡管已經(jīng)有研究結(jié)果顯示IVF子代會(huì)出現(xiàn)血管代謝紊亂、全身性和肺循環(huán)功能紊亂以及心血管結(jié)構(gòu)的重塑,但是這方面的機(jī)制尚且缺乏研究。我們的課題首先針對(duì)中國(guó)3-13歲的IVF子代及其條件吻合的對(duì)照組子代進(jìn)行了大樣本的血壓監(jiān)測(cè)；然后借助臍靜脈來(lái)模擬子代血管,試圖從蛋白水平上發(fā)現(xiàn)差異功能蛋白；關(guān)于IVF子代后期生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)生紊亂的原因,目前說(shuō)法不一,有人認(rèn)為是IVF技術(shù)本身導(dǎo)致,有人認(rèn)為是不孕因素導(dǎo)致,而我們的研究最后試圖通過(guò)臨床和基礎(chǔ)研究相結(jié)合的方式來(lái)發(fā)現(xiàn)這些蛋白差異表達(dá)的原因,從而挖掘出IVF子代血管功能紊亂的機(jī)制。 2.材料和方法： (1)對(duì)在浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院借助IVF技術(shù)和自然妊娠出生的3-13歲的子代進(jìn)行隨訪,以新鮮胚胎移植出生的單胎為實(shí)驗(yàn)組,以同期相應(yīng)的自然妊娠出生的單胎作為對(duì)照組,對(duì)其身高、體重、BMI、收縮壓、舒張壓和心率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所選的IVF均為管性不孕,另外兩組均排除子代出生時(shí)血管功能缺陷、家族型血管疾病、妊娠高血壓和妊娠高血糖。 (2)從浙江大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院分別收集IVF組和對(duì)照組臍血管14例以及45例IVF組和48例對(duì)照組臍血。入選標(biāo)準(zhǔn)為：產(chǎn)婦的年齡為25-35歲,孕周足月,單胎妊娠、出生體重為大于2500g小于4000g,剖腹產(chǎn),并且排除各種妊娠并發(fā)癥和子代出生缺陷。其中3例IVF組和3例對(duì)照組的臍靜脈用來(lái)提取蛋白用于蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)。其余用于后面的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(熒光定量PCR和western blotting)和免疫組化實(shí)驗(yàn)。利用碘雌二醇放射免疫分析藥盒測(cè)量了臍血中的雌激素濃度。 (3)體外實(shí)驗(yàn)以人類臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)為研究對(duì)象,通過(guò)不同濃度的雌激素處理,采用熒光定量PCR技術(shù)和western blotting技術(shù)檢測(cè)lumican和vimentin的表達(dá)水平。 (4)利用小RNA干擾技術(shù)將HUVECs的vimentin干擾后,利用免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)和transwell方法分別檢測(cè)細(xì)胞的形態(tài)、細(xì)胞周期和細(xì)胞的遷移能力。 3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果： (1)大規(guī)模流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示在3-6歲和6-13歲組中,IVF組的收縮壓和舒張壓均顯著性高于對(duì)照組。 (2)應(yīng)用iTRAQ檢測(cè)2組臍血管差異蛋白的表達(dá),我們總共鑒定到723個(gè)蛋白,其中上調(diào)蛋白335個(gè),下調(diào)蛋白388個(gè)。借助特征分析(Correlation-based Feature Selectim)技術(shù),根據(jù)變化倍率至少為+/-1.2倍,最終篩選到了47個(gè)差異蛋白,其中20個(gè)上調(diào),27個(gè)下調(diào)。對(duì)這47個(gè)差異蛋白進(jìn)行IPA生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白與血管系統(tǒng)發(fā)育和代謝功能相關(guān)。 (3)從蛋白組學(xué)結(jié)果中篩選了一個(gè)上調(diào)蛋白lumican和下調(diào)蛋白vimentin進(jìn)行驗(yàn)證。熒光定量PCR和western blotting結(jié)果與蛋白組學(xué)結(jié)果是一致的。(4)IVF組的臍血雌激素濃度是顯著高于對(duì)照組的。說(shuō)明IVF子代在胚胎發(fā)育過(guò)程中受到了高雌激素的刺激,因此高雌激素有可能是引發(fā)這些蛋白差異表達(dá)的重要原因。 (5)不同濃度的雌激素處理HUVECs后發(fā)現(xiàn),高濃度的雌激素會(huì)上調(diào)lumican的表達(dá),卻抑制vimentin的表達(dá)。這一結(jié)果和蛋白組學(xué)的結(jié)果是吻合的。說(shuō)明我們前面的假設(shè)“雌激素是引發(fā)IVF子代臍血管蛋白差異表達(dá)的重要因素”是正確的。 (6)把HUVECs中的vimentin干擾后,細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了皺縮,細(xì)胞周期最阻滯于S期,細(xì)胞的遷移能力也受到了抑制,說(shuō)明該蛋白的表達(dá)下調(diào)會(huì)影響到血管內(nèi)皮行使正常的生理功能。 4.結(jié)論：IVF子代臍靜脈血管中存在著與血管系統(tǒng)發(fā)育和代謝相關(guān)的差異功能蛋白的表達(dá),提示這些蛋白可能是IVF子代發(fā)生血管功能紊亂的一個(gè)重要原因,另外還發(fā)現(xiàn)IVF胚胎發(fā)育過(guò)程中的宮內(nèi)高雌激素有可能是這些蛋白差異表達(dá)的重要影響因素。這些結(jié)果初步篩選了IVF相關(guān)臍靜脈差異表達(dá)蛋白,為深入探討IVF妊娠過(guò)程中的血管異常發(fā)育機(jī)制,進(jìn)一步明確IVF與不良妊娠結(jié)局和子代健康之間的關(guān)系提供了可靠的資料。
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學(xué)位論文 第譜鑒定及表達(dá)差異分析為兩組，，IVF組和對(duì)照組，各組分別取三例擠靜脈進(jìn)行iTRAQ定及查uniport數(shù)據(jù)庫(kù)，共鑒定出723個(gè)蛋白（圖2.1)，其中根分析），以變化倍率至少為+/-1.2倍作為標(biāo)準(zhǔn)，比值大于1. 2比值小于0. 8為蛋白表達(dá)降低，總共{椴槌

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