【摘要】：在胚胎發(fā)育的一定時(shí)期,皮膚神經(jīng)末梢可以抵達(dá)表皮層的表面,從而與羊水直接接觸,隨即出現(xiàn)神經(jīng)過支配后的撤消現(xiàn)象,而對這一發(fā)育現(xiàn)象十幾年來尚無有關(guān)形成機(jī)制的研究報(bào)道。為此,本研究擬從檢測小鼠不同孕期羊水中microRNAs (miRNAs)差異表達(dá)譜著手,以探尋miRNAs對皮膚神經(jīng)發(fā)育的作用。 首先,以羊膜腔穿刺術(shù)采集13.5dpc(交配后天數(shù))、15.5dpc及17.5dpc雄性胎鼠的羊水,經(jīng)4℃下16000×g離心10min以去除細(xì)胞及細(xì)胞碎片成分,將其上清用TRIzol(?)法提取總RNA,使用基于LNATM探針的miRNAs表達(dá)譜芯片進(jìn)行檢測,對此胚胎期3個(gè)時(shí)間點(diǎn)的miRNAs表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行k-medians聚類,再按表達(dá)強(qiáng)度排序,最終選取了可能與皮膚功能有關(guān)的miR-206-3p,乍為本研究的目標(biāo)miRNA。 隨后,以小鼠胚胎12.5dpc時(shí)的骨骼肌、皮膚與大腦組織作為檢測樣本,建立了基于莖環(huán)法RT-qPCR的miR-206-3p定量檢測方法。同時(shí),對固定非包埋處理的胚胎組織,進(jìn)行多個(gè)管家基因(Snord68, Rnu6, Gapdh, Hprt, Actb)多種片段長度(92bp～349bp)的RT-qPCR擴(kuò)增,并選用不同內(nèi)參基因進(jìn)行miR-206-3p的表達(dá)數(shù)據(jù)分析。結(jié)果顯示：1)經(jīng)-20℃甲醇/DMSO固定保存的胚胎樣本,其RNA可擴(kuò)增片段長度至少為349bp,所獲得的表達(dá)分析結(jié)果與新鮮凍存組織無異,可用于mRNA與miRNA的RT-qPCR檢測；2)12.5dpc胎鼠皮膚中miR-206-3p的表達(dá)水平約為同期骨骼肌的1/4。 鑒于niR-206-3p可通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)的生成,參與胚肺氣道平滑肌的神經(jīng)支配過程,推測皮膚神經(jīng)支配過程也可能存在與此相似的調(diào)控機(jī)制。為此,對13.5dpc/15.5dpc/17.5dpc臺(tái)鼠、1dpp(出生后天數(shù))/4dpp乳鼠及16周齡雄鼠的背部全層皮膚,以RT-qPCR法檢測miR-206-3p與Bdnf mRNA的表達(dá)水平,western blotting檢測BDNF蛋白表達(dá)水平,原位雜交(ISH)與免疫組化(IHC)分別檢測miR-206-3p與BDNF的組織定位。結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-206-3p在小鼠皮膚發(fā)育過程中呈現(xiàn)以17.5dpc為中點(diǎn)的“山峰形”表達(dá)模式,明顯有別于骨骼肌中的“S形”升高趨勢；BDNF蛋白表達(dá)趨勢與miR-206-3p相反,而BdnfmRNA在17.5dpc至成體期并無顯著改變；miR-206-3p的分布在皮膚發(fā)育過程中逐漸區(qū)域化,在出生后主要分布于上基部和毛囊外周,與同期BDNF表達(dá)區(qū)域毗鄰但不重疊。據(jù)此認(rèn)為,miR-206-3p可能通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控BDNF的生成,參與了小鼠皮膚神經(jīng)發(fā)育過程。 miR-206-3p在皮膚發(fā)育過程中所分布的區(qū)域,也是角質(zhì)形成細(xì)胞(KC)開始發(fā)生角質(zhì)化或與真皮組織接觸之處,如此提示miR-206-3p的表達(dá)可能與KC的功能特化有關(guān)。為進(jìn)一步明了miR-206-3p分別在表皮與真皮組織中各自的基礎(chǔ)表達(dá)情況,對這兩種組織的主要細(xì)胞,KC與真皮成纖維細(xì)胞(DF)分別進(jìn)行原代培養(yǎng)后,再進(jìn)行有關(guān)表達(dá)分析。結(jié)果顯示,KC的miR-206-3p表達(dá)水平遠(yuǎn)低于DF(t-16.618,P=0.000,n=6),其Bdnf mRNA的表達(dá)與DF相近(t=-2.632,P=0.058,n=6),而pro-BDNF的表達(dá)要高于DF(t=-9.222,P=0.001,,n=6),其成熟型BDNF的生成量也高于DF(t=4.841,P=0.008,n=6)。KC經(jīng)1mM鈣離子誘導(dǎo)5天后,其miR-206-3p的表達(dá)略有增加,但尚無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(t=-1.721,P=0.227,n=3)；Bdnf mRNA及蛋白表達(dá)水平,在KC分化前后無明顯改變(Bdnf mRNA:t=-2.640,P=0.118；mature BDNF:t=-2.815,P=0.106；pro-BDNF:t=0.135,P=0.905；n=3)。由此推斷,miR-206-3p在皮膚中的表達(dá),不是作為表皮的自身發(fā)育信號,而是表皮在受到其它組織影響后需要作出功能轉(zhuǎn)變的一個(gè)調(diào)控環(huán)節(jié)。 最后,本研究通過剪取(?)5mm全層皮膚建立小鼠皮膚切除傷模型,以排除毛囊、腺體等附屬器在皮膚生成中的因素,再對成年小鼠皮膚創(chuàng)傷后第6、9、12天時(shí)的修復(fù)組織進(jìn)行miR-206-3p及Bdnf的表達(dá)與定位檢測。結(jié)果顯示,在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)過程中,miR-206-3p的表達(dá)一直處于較低的水平,ISH未顯示有明顯表達(dá)區(qū)域：而Bdnf mRNA及蛋白的表達(dá)經(jīng)歷了先降低后增高的過程,IHC顯示BDNF在傷后第12天時(shí)表達(dá)于上基部。miR-206-3p在皮膚胚胎期發(fā)育與成體期創(chuàng)傷修復(fù)中的表達(dá)情況既有區(qū)別也有聯(lián)系。胚胎期皮膚中的miR-206-3p通過轉(zhuǎn)錄后調(diào)控BDNF的表達(dá),以建立與調(diào)整神經(jīng)支配區(qū)域從而完成皮膚神經(jīng)的發(fā)育。而成體期皮膚創(chuàng)傷修復(fù)中miR-206-3p的這種調(diào)控作用,則只體現(xiàn)在對修復(fù)后期神經(jīng)支配的合理控制上。 本研究對miR-206-3p在皮膚發(fā)育中所進(jìn)行的探索與發(fā)現(xiàn),為這個(gè)骨骼肌特異性miRNA增添了新的認(rèn)識(shí)與理解,使我們有幸從miRNAs視角,探討皮膚神經(jīng)支配建立與調(diào)整的可能機(jī)制。對于miR-206-3p可能參與皮膚神經(jīng)發(fā)育現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn),為miRNAs的組織特異性調(diào)控作用提供了新的證據(jù),對皮膚神經(jīng)生理功能的建立具有重要啟示。進(jìn)一步對表皮細(xì)胞中miR-206-3p的表達(dá)進(jìn)行人工干預(yù),將有可能揭示某些皮膚疾病的發(fā)病機(jī)制,并有望成為臨床干預(yù)治療的新手段。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R329

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 李梅;吳建農(nóng);;一種簡單的制作多聚賴氨酸黏附載玻片方法[J];臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志;2011年05期

2 趙克芳;周婧;陳浩浩;李一喬;姜平;凌樹才;;胚胎期小鼠皮膚與羊水接觸神經(jīng)末梢發(fā)育規(guī)律的研究[J];神經(jīng)解剖學(xué)雜志;2010年03期

3 鄭軼;凌樹才;季華;孫建剛;;胚鼠皮膚神經(jīng)末梢與羊水接觸關(guān)系及其一氧化氮合酶陽性神經(jīng)末梢分布[J];細(xì)胞生物學(xué)雜志;2007年02期

4 付小兵,孫同柱,盛志勇;幾種用于創(chuàng)傷修復(fù)研究的動(dòng)物模型[J];中華實(shí)驗(yàn)外科雜志;1999年05期

，

本文編號：2659538