【摘要】：糖尿病(diabetes mellitus, DM)是胰島素絕對(duì)或相對(duì)分泌不足以及機(jī)體對(duì)胰島素敏感性降低所引起的代謝紊亂疾病。其主要臨床特征為血糖高、血脂高以及高粘血癥等,被稱(chēng)為“百病之源”。隨著人們生活水平的提高,近年來(lái)糖尿病發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)。因此,尋找更好的糖尿病治療藥物、給藥途徑和治療方法是學(xué)術(shù)界亟待解決的重要課題。糖尿病除了其本身的危害以外,往往還會(huì)帶來(lái)一系列的并發(fā)癥,這些并發(fā)癥給患者帶來(lái)了更為嚴(yán)重的后果。糖尿病患者死亡率最高的為心腦血管病變,約占80%,其中血栓的發(fā)病率為非糖尿病人的12倍。因此,在糖尿病的治療中,找到一種治療糖尿病同時(shí)又能有效預(yù)防和治療心腦血管疾病血栓等并發(fā)癥的治療方法或藥物具有十分重要的意義。 胰高血糖素樣多肽-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)是由腸道L細(xì)胞合成和分泌的由30個(gè)氨基酸組成的多肽。GLP-1具有促進(jìn)葡萄糖依賴(lài)性胰島素分泌、減少食物攝取、減慢胃排空,以及抑制胰高血糖素分泌、刺激胰β細(xì)胞增殖、促進(jìn)胰島再生、抑制胰β細(xì)胞的凋亡等特殊功能。葡萄糖依賴(lài)性促胰島素釋放激素(glucose-dependent insμlintropic polypeptide, GIP)是由腸道K細(xì)胞合成和分泌的由42個(gè)氨基酸組成的多肽。具有促進(jìn)第一時(shí)相胰島素的分泌,改善胰島素敏感性,刺激胰β細(xì)胞再生,延緩胰島素清除等作用,對(duì)2型糖尿病具有良好的治療效果。水蛭素(Hirudin, HV)是從醫(yī)蛭(Hirudomedieinalis)唾液腺中分離的一種酸性小分子蛋白,是目前發(fā)現(xiàn)的最好的凝血酶抑制劑,在預(yù)防和治療人類(lèi)心腦血管疾病方面有著非常顯著的療效,是治療心腦血管疾病的首選良藥。 本研究通過(guò)定點(diǎn)突變技術(shù)將天然GLP-1基因內(nèi)部的第8位的Ala替換成Ser,以抑制二肽酶IV(Dipeptidyl peptidase Ⅳ, DPP-Ⅳ)對(duì)其降解,并分別將第26位的Glu和第34位的Asp替換成Lys抑制胰蛋白酶的切割,克隆了抗DPP-Ⅳ和胰蛋白酶切割的GLP-1同源物,命名為重組口服長(zhǎng)效GLP-1(recombinant oral long-acting GLP-1, rolGLP-1)。通過(guò)分子克隆手段將GIP第2位的Ala用Gly替換,獲得抗DPP-Ⅳ切割的重組GIP (recombinant glucose-dependent insμlintropic polypeptide, rGIP)和重組HV(recombiant Hirudin,rHV)。將多拷貝的rolGLP-1基因分別與多拷貝的rGIP基因和單拷貝的rHV基因串聯(lián),分別獲得4rolGG(4rolGLP-4GIP)、5rolGLP-4GIP和5rolGLP-HV基因,將基因克隆到pET22b(+)載體后,分別獲得表達(dá)載體pET22b(+) pET-22b(+)-5rolGZP-4GIP和pET-22b(+)-5rolGLP-HV,轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)。轉(zhuǎn)化的工程菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,經(jīng)SDS-PAGE電泳分析證明均實(shí)現(xiàn)了這些融合多肽的高效可溶性表達(dá)。對(duì)其誘導(dǎo)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果表明：rolGG最佳表達(dá)條件為IPTG濃度為0.6mmol/L、溫度為30℃下培養(yǎng)10h;4rolGG最佳表達(dá)條件為在IPPTG終濃度為0.2mmol/L,溫度在37℃下誘導(dǎo)5h；5rolGLP-4GIP最佳表達(dá)條件為在IPTG終濃度為0.4mmol/L,溫度在30℃下誘導(dǎo)10h;5rolGLP-HV最佳表達(dá)條件為IPTG終濃度為0.4mmol/L,溫度在37℃下誘導(dǎo)5h；菌體裂解液經(jīng)超生破碎后,上清經(jīng)過(guò)Ni金屬親和層析進(jìn)行純化,分別獲得純度較高的rolGG、4rolGG、5rolGLP-4GIP和5rolGLP-HV融合多肽,為以后功能的驗(yàn)證奠定了良好基礎(chǔ)。 rolGG體外切割實(shí)驗(yàn)證明,rolGG在體外可以被修飾性胰蛋白酶切割成rolGLP-1和rGIP,切割率達(dá)到70%。 采用STZ誘導(dǎo)的2型糖尿病小鼠模型分別對(duì)rolGG、4rolGG、5rolGLP-4GIP和5rolGLP-HV融合多肽的降血糖功能進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明：與0.9%NaCl處理的陰性對(duì)照組小鼠相比,rolGG、4rolGG、5rolGLP-4GIP和5rolGLP-HV等融合多肽均可有效地降低血糖和甘油三脂、膽固醇的水平,并改善口服糖耐量,糖化血紅蛋白以及胰島素的分泌情況,并可有效改善糖尿病小鼠的多飲、多食和體重減輕等癥狀。 采用凝血酶滴定法檢測(cè)rolGLP-HV的抗凝活性,結(jié)果表明5rolGLP-HV的抗凝活性為105±1.7ATU/ml,證明5rolGLP-HV融合多肽具有HV的抗凝血功能。采用血栓模型對(duì)5rolGLP-HV融合多肽的抗血栓活性進(jìn)行了檢測(cè)。在昆明小鼠背部皮下注射角叉菜膠(50mg/kg)的同時(shí)給小鼠灌胃5rolGLP-HV融合多肽,觀察小鼠尾部出現(xiàn)血栓的時(shí)間及血栓的相對(duì)長(zhǎng)度。結(jié)果發(fā)現(xiàn),灌胃5rolGLP-HV融合多肽的小鼠出現(xiàn)血栓的時(shí)間比對(duì)照延遲致32h,相對(duì)長(zhǎng)度從37.5%縮減到25%,說(shuō)明口服5rolGLP-HV融合多肽確實(shí)可以起到抗血栓作用。 本研究為功能互補(bǔ)型雙元促胰島素rolGG以及多拷貝功能互補(bǔ)型雙元促胰島素4rolGG和5rolGLP-4GIP口服融合多肽類(lèi)藥物的研發(fā)提供了較完善的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù),并為利用口服重組融合多肽來(lái)防治2型糖尿病的臨床研究和應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。本研究結(jié)果亦表明,5rolGLP-HV融合具有明顯的治療和預(yù)防糖尿病及血栓的雙重功能,有望研發(fā)成為治療糖尿病和心腦血管病的雙功能口服藥物,為今后5rolGLP-HV融合多肽的臨床前應(yīng)用研究奠定了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：南開(kāi)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R587.2;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2659053