【摘要】：糖尿病(diabetes mellitus, DM)是胰島素絕對或相對分泌不足以及機體對胰島素敏感性降低所引起的代謝紊亂疾病。其主要臨床特征為血糖高、血脂高以及高粘血癥等,被稱為“百病之源”。隨著人們生活水平的提高,近年來糖尿病發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢。因此,尋找更好的糖尿病治療藥物、給藥途徑和治療方法是學術界亟待解決的重要課題。糖尿病除了其本身的危害以外,往往還會帶來一系列的并發(fā)癥,這些并發(fā)癥給患者帶來了更為嚴重的后果。糖尿病患者死亡率最高的為心腦血管病變,約占80%,其中血栓的發(fā)病率為非糖尿病人的12倍。因此,在糖尿病的治療中,找到一種治療糖尿病同時又能有效預防和治療心腦血管疾病血栓等并發(fā)癥的治療方法或藥物具有十分重要的意義。 胰高血糖素樣多肽-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)是由腸道L細胞合成和分泌的由30個氨基酸組成的多肽。GLP-1具有促進葡萄糖依賴性胰島素分泌、減少食物攝取、減慢胃排空,以及抑制胰高血糖素分泌、刺激胰β細胞增殖、促進胰島再生、抑制胰β細胞的凋亡等特殊功能。葡萄糖依賴性促胰島素釋放激素(glucose-dependent insμlintropic polypeptide, GIP)是由腸道K細胞合成和分泌的由42個氨基酸組成的多肽。具有促進第一時相胰島素的分泌,改善胰島素敏感性,刺激胰β細胞再生,延緩胰島素清除等作用,對2型糖尿病具有良好的治療效果。水蛭素(Hirudin, HV)是從醫(yī)蛭(Hirudomedieinalis)唾液腺中分離的一種酸性小分子蛋白,是目前發(fā)現(xiàn)的最好的凝血酶抑制劑,在預防和治療人類心腦血管疾病方面有著非常顯著的療效,是治療心腦血管疾病的首選良藥。 本研究通過定點突變技術將天然GLP-1基因內(nèi)部的第8位的Ala替換成Ser,以抑制二肽酶IV(Dipeptidyl peptidase Ⅳ, DPP-Ⅳ)對其降解,并分別將第26位的Glu和第34位的Asp替換成Lys抑制胰蛋白酶的切割,克隆了抗DPP-Ⅳ和胰蛋白酶切割的GLP-1同源物,命名為重組口服長效GLP-1(recombinant oral long-acting GLP-1, rolGLP-1)。通過分子克隆手段將GIP第2位的Ala用Gly替換,獲得抗DPP-Ⅳ切割的重組GIP (recombinant glucose-dependent insμlintropic polypeptide, rGIP)和重組HV(recombiant Hirudin,rHV)。將多拷貝的rolGLP-1基因分別與多拷貝的rGIP基因和單拷貝的rHV基因串聯(lián),分別獲得4rolGG(4rolGLP-4GIP)、5rolGLP-4GIP和5rolGLP-HV基因,將基因克隆到pET22b(+)載體后,分別獲得表達載體pET22b(+) pET-22b(+)-5rolGZP-4GIP和pET-22b(+)-5rolGLP-HV,轉化轉化大腸桿菌BL21(DE3)。轉化的工程菌株經(jīng)IPTG誘導后,經(jīng)SDS-PAGE電泳分析證明均實現(xiàn)了這些融合多肽的高效可溶性表達。對其誘導表達條件進行優(yōu)化,結果表明：rolGG最佳表達條件為IPTG濃度為0.6mmol/L、溫度為30℃下培養(yǎng)10h;4rolGG最佳表達條件為在IPPTG終濃度為0.2mmol/L,溫度在37℃下誘導5h；5rolGLP-4GIP最佳表達條件為在IPTG終濃度為0.4mmol/L,溫度在30℃下誘導10h;5rolGLP-HV最佳表達條件為IPTG終濃度為0.4mmol/L,溫度在37℃下誘導5h；菌體裂解液經(jīng)超生破碎后,上清經(jīng)過Ni金屬親和層析進行純化,分別獲得純度較高的rolGG、4rolGG、5rolGLP-4GIP和5rolGLP-HV融合多肽,為以后功能的驗證奠定了良好基礎。 rolGG體外切割實驗證明,rolGG在體外可以被修飾性胰蛋白酶切割成rolGLP-1和rGIP,切割率達到70%。 采用STZ誘導的2型糖尿病小鼠模型分別對rolGG、4rolGG、5rolGLP-4GIP和5rolGLP-HV融合多肽的降血糖功能進行了檢測。結果表明：與0.9%NaCl處理的陰性對照組小鼠相比,rolGG、4rolGG、5rolGLP-4GIP和5rolGLP-HV等融合多肽均可有效地降低血糖和甘油三脂、膽固醇的水平,并改善口服糖耐量,糖化血紅蛋白以及胰島素的分泌情況,并可有效改善糖尿病小鼠的多飲、多食和體重減輕等癥狀。 采用凝血酶滴定法檢測rolGLP-HV的抗凝活性,結果表明5rolGLP-HV的抗凝活性為105±1.7ATU/ml,證明5rolGLP-HV融合多肽具有HV的抗凝血功能。采用血栓模型對5rolGLP-HV融合多肽的抗血栓活性進行了檢測。在昆明小鼠背部皮下注射角叉菜膠(50mg/kg)的同時給小鼠灌胃5rolGLP-HV融合多肽,觀察小鼠尾部出現(xiàn)血栓的時間及血栓的相對長度。結果發(fā)現(xiàn),灌胃5rolGLP-HV融合多肽的小鼠出現(xiàn)血栓的時間比對照延遲致32h,相對長度從37.5%縮減到25%,說明口服5rolGLP-HV融合多肽確實可以起到抗血栓作用。 本研究為功能互補型雙元促胰島素rolGG以及多拷貝功能互補型雙元促胰島素4rolGG和5rolGLP-4GIP口服融合多肽類藥物的研發(fā)提供了較完善的實驗和理論依據(jù),并為利用口服重組融合多肽來防治2型糖尿病的臨床研究和應用奠定了基礎。本研究結果亦表明,5rolGLP-HV融合具有明顯的治療和預防糖尿病及血栓的雙重功能,有望研發(fā)成為治療糖尿病和心腦血管病的雙功能口服藥物,為今后5rolGLP-HV融合多肽的臨床前應用研究奠定了堅實基礎。
【學位授予單位】：南開大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R587.2;R-332

【參考文獻】

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本文編號：2659053