【摘要】：上皮向間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)是指上皮細胞在某些生理或病理條件下失去上皮特性轉(zhuǎn)變?yōu)殚g充質(zhì)細胞的現(xiàn)象，EMT過程中不但有細胞表型的變化，而且包括細胞標(biāo)志物的改變：失去上皮細胞標(biāo)志物，如鈣粘附蛋白(E-Cadherin，E-Ca)；獲得間質(zhì)細胞標(biāo)志物，如波形蛋白(Vimentin，Vim)和α-平滑肌肌動蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)。此外，伴隨著EMT的發(fā)生，細胞還出現(xiàn)形態(tài)改變、遷移能力增加等變化。Kalluri R等依據(jù)EMT的發(fā)生條件和所導(dǎo)致的結(jié)果不同將其分為三種類型:在胚胎形成和器官發(fā)育過程中所發(fā)生的EMT被歸類為Ⅰ型，此型EMT既不引起器官纖維化也不引起細胞侵襲轉(zhuǎn)移，其結(jié)果是細胞經(jīng)過間質(zhì)向上皮轉(zhuǎn)化再次轉(zhuǎn)變?yōu)樯掀ぜ毎辉诮M織修復(fù)和器官纖維化過程中所發(fā)生的EMT被歸類為Ⅱ型，此型EMT主要是由于慢性炎癥長期刺激使上皮細胞向間質(zhì)轉(zhuǎn)化，進而分泌膠原成分并最終導(dǎo)致器官的損害；在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和癌細胞的轉(zhuǎn)移、侵襲過程所出現(xiàn)的EMT被歸類為Ⅲ型，這一類型EMT主要原因是癌細胞遺傳基因改變或是細胞不可調(diào)控的生長方式，最終導(dǎo)致癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。EMT的發(fā)生受到多種基因和生長因子的調(diào)控，如Twist基因、肝細胞生長因子(HGF)、表皮生長因子(EGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF-β)等均可以誘導(dǎo)EMT發(fā)生,也可以引起細胞的增殖,這取決于局部微環(huán)境與信號分子之間的相互作用。目前研究發(fā)現(xiàn)大多數(shù)生長因子,如EGF可以通過與其受體相結(jié)合，激活受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases, RTKs),進而促進EMT過程。由此可見，深入研究EMT發(fā)生機制、并有效阻抑EMT進展對器官纖維化和實體瘤轉(zhuǎn)移等相關(guān)疾病的治療非常關(guān)鍵。 神經(jīng)膠質(zhì)瘤致病相關(guān)蛋白-2(Glioma pathogenesis related-2，GLIPR-2)屬于PR-1蛋白家族(pathogenesis related-1，PR-1)，編碼序列為465bp，蛋白分子量大小約為17KD，該基因在人體僅表達在外周血單核細胞、脾臟和肺臟。Ruth M. Baxter等曾報道GLIPR-2基因在奧爾波特(COL4A3基因敲出)小鼠的腎臟中表達增高，其蛋白可以作用小鼠腎小管上皮細胞下調(diào)上皮細胞標(biāo)志物E-Ca的表達，提示GLIPR-2在EMT過程中有著重要的作用。本課題組的研究發(fā)現(xiàn)，GLIPR-2在糖尿病腎病(Diabetic Nephropathy，DN，Ⅱ型EMT)的腎小管上皮細胞和肝癌組織(Hepatocellular carcinoma，HCC，Ⅲ型EMT)的局部特異性表達，表明該基因可能參與了Ⅱ、Ⅲ型EMT過程。但是，GLIPR-2促進EMT的機制和治療學(xué)意義尚需深入探討。 目的 檢測GLIPR-2在糖尿病腎病和原發(fā)性肝癌組織標(biāo)本中的表達并探討促進GLIPR-2上調(diào)的因素，，分析其與EMT的作用關(guān)系及相關(guān)信號通路，以期闡明該基因促進EMT機制，為器官纖維化和實體瘤轉(zhuǎn)移等相關(guān)疾病的治療提供新的思路。 方法 1.利用免疫組化技術(shù)首先檢測正常腎臟和糖尿病腎病腎組織標(biāo)本、正常肝和原發(fā)性肝癌組織標(biāo)本中GLIPR-2的表達差異；用含濃度為5、10、20、30mM葡萄糖的DMEM低糖培養(yǎng)基培養(yǎng)近端腎小管上皮細胞株HK-27天，在缺氧條件下培養(yǎng)肝癌細胞株HepG2細胞72h，利用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time RT-PCR)和蛋白質(zhì)印跡(WesternBlotting)技術(shù)檢測不同時相點GLIPR-2核酸和蛋白水平的變化，探討促進GLIPR-2上調(diào)的因素。 2.利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)建立穩(wěn)定表達GLIPR-2基因的HK-2細胞和對照組細胞，采用生物信息學(xué)預(yù)測候選相關(guān)的靶基因，并進一步利用Western Blotting和qRT-PCR對報告基因?qū)嶒炦M行實驗驗證。 3.建立瞬時表達GLIPR-2基因的HepG2細胞和對照組細胞，用免疫熒光、real-timeRT-PCR及Western Blotting技術(shù)檢測EMT相關(guān)標(biāo)志分子物表達的變化，并進行相關(guān)信號通路的檢測確認。 4.采用Transwell實驗檢測對照組細胞和實驗組細胞侵襲與遷移能力的改變。 5.采用siRNA干擾技術(shù)，在缺氧條件下抑制GLIPR-2基因在HepG2細胞的表達，再檢測對照組和干擾組細胞EMT相關(guān)分子標(biāo)志物和侵襲與遷移能力的變化，以進一步確認GLIPR-2與EMT的關(guān)系。 結(jié)果 1.免疫組化染色結(jié)果顯示，GLIPR-2在正常腎組織中沒有表達而在糖尿病腎病(Ⅱ型EMT)組織的腎小管上皮細胞中特異性表達，同時與對照組比較EMT相關(guān)分子標(biāo)志物E-Ca在糖尿病腎病組織的腎小管上皮細胞表達下調(diào)、而Vim和α-SMA在其中表達上調(diào)；體外實驗證實，5、10、20、30mM葡萄糖作用7天后GLIPR-2的表達量隨葡萄糖濃度的增加逐漸升高，20mM葡萄糖作用7天后GLIPR-2的表達量隨時間的延長而升高；GLIPR-2在正常肝組織中沒有表達而在肝癌組織(Ⅲ型EMT)的部分區(qū)域中特異性表達，在缺氧條件下的肝癌細胞株HepG2中，GLIPR-2的表達量隨時間的延長而增加。 2. EMT芯片(對照組細胞和轉(zhuǎn)染GLIPR-2的HK-2細胞)篩選獲得了多個與EMT相關(guān)的差異表達基因，qRT-PCR驗證的結(jié)果與芯片一致；Western Blotting和qRT-PCR結(jié)果顯示，與對照組相比轉(zhuǎn)染GLIPR-2的細胞中上皮細胞標(biāo)志物E-Ca的表達明顯上調(diào)，間質(zhì)細胞標(biāo)志物Vim和α-SMA的表達明顯上調(diào)。 3.與對照組相比轉(zhuǎn)染GLIPR-2后，近端腎小管上皮細胞株HK-2和肝癌細胞株HepG2的遷移和侵襲能力明顯增高。 4.磷酸化ERK1/2通路參與了GLIPR-2促進EMT過程。根據(jù)芯片結(jié)果中EGFR基因表達上調(diào)的提示，其下游的ERK1/2通路可能與EMT相關(guān)。轉(zhuǎn)染GLIPR-2后，實驗組的磷酸化ERK1/2水平升高，磷酸化ERK1/2特異性阻斷劑PD98059可明顯抑制GLIPR-2誘導(dǎo)的EMT表型和遷移能力的變化。 5.采用siRNA干擾技術(shù)，在缺氧條件下HepG2細胞中抑制GLIPR-2表達，可明顯抑制EMT表型和遷移侵襲能力的變化。 結(jié)論 1. GLIPR-2在糖尿病腎病組織中的腎小管上皮細胞特異性表達，高糖條件可以促使GLIPR-2在HK-2細胞中表達； 2.通過EMT芯片和Western Blotting分析發(fā)現(xiàn)，GLIPR-2在HK-2細胞中表達可以活化ERK1/2磷酸化依賴通路促進EMT過程，并伴隨著細胞遷移能力的增加； 3. GLIPR-2在肝癌組織中局部特異性表達，缺氧微環(huán)境是可以使HepG2細胞中GLIPR-2的表達增加； 4. GLIPR-2在HepG2細胞中表達同樣可以通過增加p-ERK水平進而促進EMT的發(fā)生并使肝癌細胞遷移和侵襲能力增加； 5.缺氧條件下抑制GLIPR-2的表達，可以明顯阻抑EMT的發(fā)生，進而阻斷腫瘤細胞的遷移和侵襲，將GLIPR-2作為防治腫瘤細胞轉(zhuǎn)移提供新的靶點。 總之，本研究首次發(fā)現(xiàn)GLIPR-2可以通過磷酸化ERK1/2通路促進EMT的發(fā)生，抑制該基因的表達，可以阻抑EMT的發(fā)生，為防治器官纖維化和實體瘤的轉(zhuǎn)移及相關(guān)疾病提供了新的思路。
【圖文】：

第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文皮細胞發(fā)生了 EMT 現(xiàn)象；而 GLIPR-2 和 p-ERK 在糖尿病腎病的小管，該基因可能通過磷酸化ERK1/2 通路促進了EMT 的發(fā)生。

第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 高糖誘導(dǎo) GLIPR-2 在 HK-2 細胞表達糖濃度為 20 mM 的 DMEM 低糖培養(yǎng)基培養(yǎng) HK-2 細胞 4 d，經(jīng)2 的 mRNA 表達水平升高(圖 2)；Western Blotting 結(jié)果顯示，20、30 mM 的培養(yǎng)基培養(yǎng) HK-2 細胞 7 天后，GLIPR-2 蛋白水而逐漸增多(圖 3)；葡萄糖濃度為 20 mM 的培養(yǎng)基培養(yǎng) HK-2白表達水平隨時間的增加而逐漸升高(圖 4)。這說明高糖誘導(dǎo)表達。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R363

【共引文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 李洋;張清富;王洋;邱雪杉;王恩華;;缺氧對肺癌細胞CCR7表達及其侵襲力的影響[J];中國肺癌雜志;2008年05期

2 孫文;吳麗麗;皮特;敬珊珊;艾志敏;郭翔宇;楊麗霞;穆曉紅;李娟娥;劉銅華;;止消通脈寧對糖尿病腎病小鼠腎間質(zhì)纖維化作用機制的研究(英文)[J];中華中醫(yī)藥雜志;2013年05期

3 蔣國燕;李瑾;施露;曹進;張獻全;;RNAi沉默MACC1基因表達抑制乳腺癌MCF-7細胞增殖和遷移[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2013年18期

4 劉兆宇;蘇君;金華;任歡;;腦腫瘤微環(huán)境影響膠質(zhì)母細胞瘤侵襲行為的研究進展[J];中國神經(jīng)腫瘤雜志;2013年02期

5 鐘寶元;劉艷秀;;腫瘤中STAT3、P-STAT3的表達及與EMT關(guān)系的研究進展[J];贛南醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2013年04期

6 熊德明;張瑤;王國平;李剛;徐曉剛;冉文華;劉學(xué)芬;;FOXC2和Vimentin蛋白在胃癌中的表達及意義[J];重慶醫(yī)學(xué);2013年30期

7 張磊;吳繼鋒;孫雪竹;孫景洲;;胃癌組織中Twist、STAT3和E-cad的表達及其臨床意義[J];蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2013年10期

8 朱瀟鵬;徐慶福;呂勝青;;miR-21與AP-1構(gòu)成的自我調(diào)節(jié)環(huán)路在腦膠質(zhì)瘤中的研究進展[J];國際神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)雜志;2013年04期

9 張樂樂;黃紹光;蔣棟能;李毅;劉飛;蒲曉允;;人GLIPR-2基因慢病毒RNAi載體的構(gòu)建及鑒定[J];國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志;2013年24期

10 Shi-Ping Liu;Jia-Xin Yang;Dong-Yan Cao;Keng Shen;;Identification of differentially expressed long non-coding RNAs in human ovarian cancer cells with different metastatic potentials[J];Cancer Biology & Medicine;2013年03期

相關(guān)會議論文 前1條

1 孫文;吳麗麗;皮特;敬珊珊;艾志敏;郭翔宇;楊麗霞;穆曉紅;李娟娥;劉銅華;;止消通脈寧對糖尿病腎病小鼠腎間質(zhì)纖維化作用機制的研究（英文）[A];第四屆全國中醫(yī)藥博士生優(yōu)秀論文專輯[C];2013年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 熊明霞;microRNA在腎間質(zhì)纖維化中作用的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2010年

2 黃學(xué)鋒;ANGPTL4基因表達對大腸癌細胞生物學(xué)特性變化的影響及機理的研究[D];浙江大學(xué);2011年

3 郭小舟;糖微康膠囊對早期糖尿病腎病的干預(yù)及療效機理研究[D];中國中醫(yī)科學(xué)院;2011年

4 廖芝玲;uPA及V-ATPase在肝細胞癌的表達及其與浸潤轉(zhuǎn)移的關(guān)系[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2007年

5 劉理禮;HIF-1在缺氧誘導(dǎo)胃癌MDR中的機制研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2007年

6 殷濤;上皮向間葉轉(zhuǎn)化（EMT）在胰腺癌侵襲和轉(zhuǎn)移過程中的發(fā)生及機制研究[D];華中科技大學(xué);2007年

7 丁召;腺病毒介導(dǎo)的反義細胞外信號調(diào)節(jié)激酶2基因治療抑制腎小管上皮—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化并延緩大鼠移植腎腎病[D];華中科技大學(xué);2009年

8 唐文彬;SARA在糖尿病腎病腎小管上皮細胞轉(zhuǎn)分化中的作用與分子機制[D];中南大學(xué);2010年

9 沈源明;MiR-375參與宮頸癌泰素敏感性調(diào)節(jié)的機制研究[D];浙江大學(xué);2012年

10 趙華;惡性黑素瘤的轉(zhuǎn)錄組學(xué)及轉(zhuǎn)移相關(guān)分子機制的研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學(xué)院;2013年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 周頻;兒童激素耐藥型與激素敏感型腎病綜合征腎小管上皮細胞—間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）及其意義[D];中南大學(xué);2008年

2 楊光磊;模擬缺氧條件下結(jié)腸癌細胞耐藥及抗凋亡分子機制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2009年

3 胡春淼;磁共振全身擴散加權(quán)成像在宮頸癌分期中的應(yīng)用研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2009年

4 肖宏;糖尿病大鼠腎小管MK和TGF-β表達的動態(tài)觀察[D];南華大學(xué);2008年

5 涂崇興;MONCPT抗黑色素瘤轉(zhuǎn)移的作用及其機制研究[D];浙江大學(xué);2009年

6 蔡小攀;口腔鱗癌生物學(xué)特點與HIF-1α、VEGF等基因表達的關(guān)系[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2010年

7 唐寧;LASS2在肝癌生長和轉(zhuǎn)移中的作用[D];復(fù)旦大學(xué);2009年

8 劉德綱;晚期肺腺癌患者EGFR基因突變檢測及化療療效觀察[D];南方醫(yī)科大學(xué);2012年

9 吳丹;腎小管上皮細胞表型轉(zhuǎn)化與移植腎纖維化的相關(guān)性[D];吉林大學(xué);2013年

10 鄭江南;RGD修飾的IL-24-PTEN雙基因共表達重組腺病毒載體對吉非替尼獲得性耐藥肺癌細胞株影響的基礎(chǔ)研究[D];蘇州大學(xué);2013年

本文編號：2657366