【摘要】：盡管反義核酸、Ribozyme、DNA enzyme以及雙鏈RNA干涉小分子與mRNA分子在一級(jí)結(jié)構(gòu)上嚴(yán)格按Watson-Crick堿基匹配原則互補(bǔ)配對(duì)發(fā)揮作用，然而能有效結(jié)合發(fā)揮作用的卻是那些接近mRNA分子高度折疊結(jié)構(gòu)的“靶點(diǎn)”的反義序列。本工作的主要目標(biāo)是建立mRNA靶點(diǎn)的篩選方法，運(yùn)用反義設(shè)計(jì)技術(shù)進(jìn)行基因治療和基因功能研究。 首先，采用單鏈寡核苷酸隨機(jī)序列文庫(kù)，首次應(yīng)用3’末端固定方法使mRNA在液相中的自然狀態(tài)下與其進(jìn)行雜交，通過(guò)洗脫、篩選，獲得mRNA的結(jié)合文庫(kù)序列，闡明mRNA全部結(jié)構(gòu)靶點(diǎn)，建立了一種新的mRNA靶點(diǎn)篩選的分子生物學(xué)方法RASS(RNA accessible sites screening)。 其次，用RASS方法和文獻(xiàn)報(bào)道的MAST(mRNA accessible sites tagging)技術(shù)同時(shí)對(duì)模型基因--綠色熒光蛋白GFP的mRNA進(jìn)行了靶點(diǎn)篩選，應(yīng)用RASS獲得GFP mRNA上3個(gè)結(jié)合靶點(diǎn)1，2，4，采用MAST方法獲得了1，2，3和4等4個(gè)靶點(diǎn)，其中1、2、4與RASS的3個(gè)靶點(diǎn)完全相同。體外，4個(gè)靶點(diǎn)中1、2、4號(hào)靶點(diǎn)的反義核酸有效，2和4號(hào)的結(jié)合效果最好；細(xì)胞內(nèi)1、2、4號(hào)的反義核酸明顯而特異抑制了熒光蛋白表達(dá)，2號(hào)反義核酸突變2個(gè)堿基的對(duì)照組在體外體內(nèi)均喪失了作用效果。 對(duì)2號(hào)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)了向5’和向3’移位的多條反義核酸(分別錯(cuò)位4個(gè)和8個(gè)堿基的反義核酸A2-8、A2-4、A2+4、A2+8)，實(shí)驗(yàn)表明，只有2號(hào)靶點(diǎn)反義核酸的作用效果最好，據(jù)RASS所設(shè)計(jì)合成的反義核酸序列準(zhǔn)確，是最佳設(shè)計(jì)的反義核酸序列。 10-23DNA enzyme的體內(nèi)體外作用活性和反義核酸組完全相同，四個(gè)靶點(diǎn)的2和4號(hào)靶點(diǎn)的10-23DNA enzyme切割效果最好，1號(hào)其次，3號(hào)效果不佳。細(xì)胞內(nèi)抑制效果與之相同。10-23DNA enzyme的體外體內(nèi)作用活性正確反映了反義核酸結(jié)合有效性，提出：10-23DNA enzyme可以作為體外評(píng)價(jià)mRNA結(jié)構(gòu)靶點(diǎn)的工具。 博}一學(xué)位論文 論文摘要 設(shè)計(jì)l小23DNA enzyme對(duì)照組時(shí)，如果突變錯(cuò)配的堿基位于切割位置的左右堿基使 10一23DNA enzyme突環(huán)結(jié)合能力降低，體外喪失了對(duì)mRNA的降解能力，但在細(xì)胞內(nèi)仍 抑制GFP基因表達(dá)，10一23DNA enzyme的結(jié)合臂序列發(fā)揮了反義核酸作用。10一23DNA enzyme對(duì)照組突變10一23DNA en即me兩個(gè)結(jié)合臂中間堿基，使10一23DNA enzyme保留突 環(huán)結(jié)合能力、降低兩臂結(jié)合能力，則喪失了對(duì)mRNA的降解能力，細(xì)胞內(nèi)也喪失了抑制 GFP基因表達(dá)。 !o一23DNA enzyme自身具切割mRNA的活性，用實(shí)驗(yàn)證明了10一23DNA enzyme的側(cè) 翼結(jié)合臂序列與RNA互補(bǔ)結(jié)合以后能發(fā)揮誘導(dǎo)RNaseH的酶促降解mRNA作用，認(rèn)為 10一23DNA enzyme能產(chǎn)生比反以核酸更理想的基因抑制效果。證明DNA enzyme在細(xì)胞 內(nèi)具有雙重活性，比反義核酸有更好的應(yīng)用潛力。 第三，將RAsS方法和MAsT方法、計(jì)算機(jī)軟件RNAstructure3.71模擬方法對(duì)GFP的 靶點(diǎn)，MAsT方法和RNAstructure3 .71模擬方法對(duì)小鼠Fas基因，兔p一globin基因片段的靶 點(diǎn)進(jìn)行了比較。 RNAstructure3.71模擬長(zhǎng)度較短的基因靶點(diǎn)正確。據(jù)MAST技術(shù)獲得的兔 (oryetolagus eunieulus)p一globin基因mRNA(屬于122nt的小基因片段)的靶點(diǎn)2個(gè)，和計(jì) 算機(jī)軟件RNAstructure3.71模擬分析的位點(diǎn)，也和寡核普酸微陣列雜交技術(shù)篩選獲得的 靶點(diǎn)結(jié)果(NatazieM，1 997)完全一致。 已經(jīng)證明綠色熒光蛋白(GFP) mRNA4個(gè)結(jié)構(gòu)靶點(diǎn)中2，4號(hào)是高效結(jié)合靶點(diǎn)，MAsT 技術(shù)獲得了4號(hào)，但是它把2號(hào)靶點(diǎn)當(dāng)作了低頻率、低效靶點(diǎn)從而忽略了2號(hào)靶點(diǎn)，得到 了3號(hào)無(wú)效靶點(diǎn);RASS得到的靶點(diǎn)均有效，可能因?yàn)镽NA“隨機(jī)”標(biāo)記技術(shù)導(dǎo)致了MAST 對(duì)有效靶點(diǎn)的忽視;而R了、55采用末端標(biāo)記，能夠獲得全部有效靶點(diǎn)。 RNAstrueture3.71軟件分析的靶點(diǎn)與GFP的4個(gè)靶點(diǎn)中有3個(gè)相同，約有50%一60%能 被預(yù)測(cè)得到。MAST篩選了1 .skb小鼠Fas基因2個(gè)靶點(diǎn)(1，2)，只有一個(gè)最有可能被 RNAstructure軟件預(yù)測(cè)分析得到(靶點(diǎn)2)，尚有許多其它可能的靶點(diǎn)。軟件分析模擬推薦 的結(jié)構(gòu)靶點(diǎn)較多，隨著基因長(zhǎng)度增加計(jì)算機(jī)軟件分析確認(rèn)靶點(diǎn)的難度增大，預(yù)測(cè)的靶點(diǎn) 需要實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，但是它對(duì)實(shí)驗(yàn)篩選靶點(diǎn)、設(shè)計(jì)反義核酸有輔助價(jià)值。RAss和MAsT等 實(shí)驗(yàn)篩選方法能篩選各種長(zhǎng)度基因mRNA的靶點(diǎn)，比軟件預(yù)測(cè)具有簡(jiǎn)單、快捷和有效的 優(yōu)，點(diǎn)。 博卜‘學(xué)位論義 論文摘要 第四，由于RASS和MAST方法在應(yīng)用中，需要一條一條地測(cè)定成百條序列，1次測(cè) 序反應(yīng)獲得1條文庫(kù)小片段序列，測(cè)定過(guò)程繁雜，消耗大量人力和物力，不利于其在普 通實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。本研究自行建立了兩個(gè)專(zhuān)利方法，其一采用小序列酶切、連接、克 隆測(cè)序，其二通過(guò)設(shè)計(jì)搭橋引物、擴(kuò)增達(dá)到連接而完成連接測(cè)序的目的。文庫(kù)小片段序 列通過(guò)連接進(jìn)行測(cè)序，，1次測(cè)序反應(yīng)可以獲得8至20條文庫(kù)小片段序列，其費(fèi)用約為原始 方法的二十分之一至八分之一。此方法快速而經(jīng)濟(jì)，能滿(mǎn)足普通實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用凡ASS， MAS’I’篩選靶點(diǎn)的需求。
【圖文】：

圖1.RASS技術(shù)篩選靶點(diǎn)原理簡(jiǎn)圖2圖3圖4圖6基因的PCR擴(kuò)增1.6kbP;圖3.IA6基因轉(zhuǎn)錄得到的cRNA8oobp擴(kuò)增產(chǎn)物6ObP;圖5.文庫(kù)序列的擴(kuò)增產(chǎn)物插入T載體的陽(yáng)性DNA標(biāo)準(zhǔn)分子量采用TAKARA公司的DLZoo0Marker分別為:。)

博卜學(xué)位論文第二部分結(jié)果GFP基因轉(zhuǎn)錄模板DNA和eRNAPCR擴(kuò)增得到75obp大小的GFp基因轉(zhuǎn)錄模板DNA和cRNA(圖2，3)，產(chǎn)物兩端分別被引入了T3啟動(dòng)子序列和PolyA序列。以此產(chǎn)物為模板，在T3RNApolymerase的作用下，37oCl.sh后可獲得優(yōu)質(zhì)的RNA(圖3)，此RNA產(chǎn)物的末端為PolyA。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類(lèi)號(hào)】：R346

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本文編號(hào)：2657223