【摘要】：糖尿病是由于分泌胰島素的β細(xì)胞缺失或功能異常而引起的糖代謝異常疾病。目前，盡管多種藥物尤其是胰島素的應(yīng)用對(duì)糖尿病的治療效果有了很大改善，但還沒(méi)有一種治療手段可以完全治愈糖尿病，阻止其并發(fā)癥的發(fā)生。除了Ⅰ型糖尿病的中β細(xì)胞總數(shù)的缺乏外，新近研究發(fā)現(xiàn)在Ⅱ型糖尿病患者胰腺中同樣存在β細(xì)胞團(tuán)減少的現(xiàn)象，因此通過(guò)胰腺或胰島移植是根治糖尿病的唯一手段，但是供體胰島的嚴(yán)重缺乏限制了其廣泛開(kāi)展。干細(xì)胞因其多向分化潛能和自我更新的特性，已被越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于細(xì)胞替代治療的研究中。然而，，將干細(xì)胞真正用于糖尿病的臨床治療還面臨許多問(wèn)題。 細(xì)胞數(shù)量和功能不足是干細(xì)胞治療糖尿病所面臨的主要挑戰(zhàn)。盡管近年來(lái)，已經(jīng)建立了使用生長(zhǎng)因子和小分子化合物，將多能干細(xì)胞分化為胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞的方法，但是多能干細(xì)胞分化成為內(nèi)分泌細(xì)胞需經(jīng)過(guò)定型內(nèi)胚層，胰腺祖細(xì)胞，內(nèi)分泌祖細(xì)胞以及特定類(lèi)型內(nèi)分泌細(xì)胞五個(gè)階段，誘導(dǎo)時(shí)間長(zhǎng)，不可控制的因素多，所以，目前還沒(méi)有一種方法可以獲得足夠數(shù)量、終末分化的功能性胰島細(xì)胞。研究認(rèn)為，胰島的結(jié)構(gòu)和胰島細(xì)胞間的相互作用決定胰島細(xì)胞的功能，三維(threedimentional,3D)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)可通過(guò)恢復(fù)細(xì)胞與細(xì)胞間的相互關(guān)系彌補(bǔ)2D培養(yǎng)技術(shù)的不足，本課題擬利用3D培養(yǎng)技術(shù)從組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞間相互作用的角度進(jìn)行研究，嘗試解決替代細(xì)胞分化效率和功能成熟的問(wèn)題。 3D培養(yǎng)技術(shù)因其在體外構(gòu)建與體內(nèi)相近的細(xì)胞發(fā)育結(jié)構(gòu)系統(tǒng)，成為研究細(xì)胞-細(xì)胞，細(xì)胞-基質(zhì)間相互作用最直觀(guān)的體外細(xì)胞培養(yǎng)模型，大量研究已證明，3D環(huán)境下的誘導(dǎo)分化效率高于2D環(huán)境，并且3D細(xì)胞培養(yǎng)可以恢復(fù)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)并提高細(xì)胞的功能。但是3D培養(yǎng)是否可以促進(jìn)胚胎干細(xì)胞向胰島細(xì)胞的分化，3D結(jié)構(gòu)的細(xì)胞生長(zhǎng)模式與胰島細(xì)胞功能成熟之間的關(guān)系還不清楚�；谝陨峡紤]，本課題分為兩部分，第一部分的工作旨在探索3D細(xì)胞培養(yǎng)與胰島細(xì)胞功能之間的關(guān)系；第二部分在第一部分工作的基礎(chǔ)上，利用3D細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，模仿體內(nèi)胰島生長(zhǎng)微環(huán)境，探討3D細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)人胚胎干細(xì)胞（human embryonic stemcells, hESC）向胰島細(xì)胞分化過(guò)程中的影響，并初步分析其作用機(jī)制，為體外獲得有功能的種子細(xì)胞提供技術(shù)支持和理論基礎(chǔ)。 一、三維細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)胰島細(xì)胞功能的影響及其機(jī)制研究：通過(guò)懸浮培養(yǎng)小鼠β細(xì)胞系MIN6細(xì)胞，形成類(lèi)組織樣結(jié)構(gòu)的MIN6細(xì)胞團(tuán)(3D-MIN6)，葡萄糖刺激胰島素釋放(GSIS)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，3D-MIN6較2D-MIN6在葡萄糖刺激下可以釋放更多的胰島素，q-PCR顯示3D-MIN6中胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)上調(diào)，提示3D細(xì)胞培養(yǎng)可以增強(qiáng)β細(xì)胞的基因表達(dá)和GSIS功能。RhoA和ROCK功能阻斷實(shí)驗(yàn)表明，3D-MIN6細(xì)胞通過(guò)抑制RhoA/ROCK通路，使F-actin重構(gòu)，易化胰島素釋的釋放過(guò)程，另外，3D細(xì)胞培養(yǎng)和RhoA/ROCK功能阻斷可使細(xì)胞縫隙連接蛋白36（Connexin36, Cx36）的表達(dá)增高，而通過(guò)siRNA技術(shù)阻斷Cx36功能后，MIN6細(xì)胞的GSIS明顯降低，即使抑制RhoA/ROCK活性也不能恢復(fù)MIN6的胰島素釋放功能，提示Rho/ROCK信號(hào)通路通過(guò)Cx36發(fā)揮調(diào)節(jié)胰島素釋放的作用。第一部分的研究表明3D細(xì)胞培養(yǎng)通過(guò)抑制RhoA/ROCK的活性，可以促進(jìn)Cx36的表達(dá)，進(jìn)而加強(qiáng)MIN6細(xì)胞的GSIS功能。 二、誘導(dǎo)人胚胎干細(xì)胞向胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞分化及其機(jī)制研究：本研究首先利用細(xì)胞因子和小分子化合物組合建立了誘導(dǎo)hESC向胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞(pancreaseendocrine cell, PEC)的分化體系，通過(guò)27天的誘導(dǎo)，hESC來(lái)源的PEC可以合成內(nèi)分泌激素胰島素、胰高血糖素和生長(zhǎng)抑素，并且能在Fosklin、KCL的刺激下分泌胰島素，但是對(duì)與葡萄糖的刺激反應(yīng)微弱。在此基礎(chǔ)上，我們分別對(duì)誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)行了簡(jiǎn)單的懸浮3D培養(yǎng)和基質(zhì)材料Matrigel包埋的3D細(xì)胞培養(yǎng)，與常規(guī)2D培養(yǎng)相比，3D培養(yǎng)加強(qiáng)了hESC來(lái)源的PEC的內(nèi)分泌特異性，使胰島素陽(yáng)性細(xì)胞的分化效率提高到23.7%，細(xì)胞內(nèi)胰島素的含量明顯增多，并且具備了GSIS的能力。通過(guò)對(duì)影響細(xì)胞間相互作用的粘著斑激酶(focal adhesion kinase, FAK)研究發(fā)現(xiàn)，3D組誘導(dǎo)細(xì)胞中FAK活性明顯低于2D組，抑制FAK或其下游ROCK的表達(dá)，可以促進(jìn)內(nèi)分泌細(xì)胞定向分化的相關(guān)基因NGN3、NKX6.1、ISL1的上調(diào)表達(dá)，說(shuō)明FAK和ROCK通路參與了3D培養(yǎng)促進(jìn)內(nèi)分泌細(xì)胞定向分化的過(guò)程。另外TGFβ信號(hào)通路已被證實(shí)具有調(diào)節(jié)內(nèi)分泌細(xì)胞定向分化的作用，我們Western blot結(jié)果顯示，下調(diào)FAK活性亦可抑制TGFβ下游Smad2的活性。在3D組誘導(dǎo)細(xì)胞中還發(fā)現(xiàn)Cx36表達(dá)明顯上調(diào)，抑制FAK和ROCK通路同樣可以提高Cx36基因合成和蛋白表達(dá)，說(shuō)明3D培養(yǎng)通過(guò)FAK、ROCK信號(hào)通路調(diào)控Cx36的合成與表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)細(xì)胞GSIS的功能。小鼠體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)移植入體內(nèi)的PEC可以合成胰島素并根據(jù)體內(nèi)血糖水平調(diào)節(jié)其釋放。 綜上所述，本課題的研究表明，3D細(xì)胞培養(yǎng)條件有利于小鼠β細(xì)胞系MIN6胰腺發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)和GSIS功能的發(fā)揮。在hESC向PEC的分化過(guò)程中，3D細(xì)胞培養(yǎng)通過(guò)抑制FAK及其下游信號(hào)通路ERK、ROCK、Smad2，可以提高PEC的分化效率和增強(qiáng)GSIS功能。該研究不僅為3D環(huán)境可以增強(qiáng)β細(xì)胞功能和促進(jìn)hESC向PEC分化提供了新的理論和技術(shù)基礎(chǔ)，也給糖尿病患者應(yīng)用細(xì)胞替代治療帶來(lái)了新的希望。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R329.2;R587.1

【共引文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 陳黎紅;嚴(yán)勵(lì);吳木潮;徐明彤;楊川;傅祖植;;體內(nèi)回輸骨髓干細(xì)胞對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病小鼠作用的初步研究[J];中華內(nèi)分泌代謝雜志;2006年02期

相關(guān)會(huì)議論文 前1條

1 吳杭格;宋海龍;蘭海楠;趙小麗;鄭鑫;;胰島干細(xì)胞的研究進(jìn)展[A];吉林省畜牧獸醫(yī)學(xué)會(huì)2007學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C];2007年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前7條

1 楊開(kāi)明;胰島發(fā)生、發(fā)育和再生及相關(guān)基因的研究[D];四川大學(xué);2006年

2 遲作華;臍血間充質(zhì)干細(xì)胞向肝樣細(xì)胞和胰島樣細(xì)胞的分化研究[D];暨南大學(xué);2006年

3 楊明;胰腺大部分切除誘導(dǎo)大鼠胰腺增生早期的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];華中科技大學(xué);2006年

4 陳國(guó)江;抗CD3單克隆抗體治療Ⅰ型糖尿病及機(jī)制的研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2007年

5 葛秀國(guó);山羊胚胎干細(xì)胞的分離與培養(yǎng)[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2007年

6 閆志風(fēng);人胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為胰島素分泌細(xì)胞的研究[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2008年

7 謝秋萍;體外微環(huán)境調(diào)控誘導(dǎo)人源性骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞分化及移植研究[D];浙江大學(xué);2008年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前8條

1 李園;成人Bartter綜合征一例及Bartter和Gitelman綜合征研究進(jìn)展[D];浙江大學(xué);2003年

2 王清勇;新生SD大鼠島源性胰島祖細(xì)胞的分離培養(yǎng)與誘導(dǎo)分化[D];鄭州大學(xué);2004年

3 王偉峰;胰島干/祖細(xì)胞的體外擴(kuò)增、誘導(dǎo)分化及移植實(shí)驗(yàn)[D];鄭州大學(xué);2005年

4 李金金;β細(xì)胞素基因多態(tài)性與2型糖尿病及其胰島功能關(guān)系的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2006年

5 林媛媛;羅格列酮鈉對(duì)實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠殘存β細(xì)胞功能的影響[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2006年

6 吳娟利;體外誘導(dǎo)小鼠胚胎干細(xì)胞分化為胰島素分泌細(xì)胞[D];浙江大學(xué);2006年

7 王寧薦;不同大鼠肝臟模型中分離卵圓細(xì)胞的研究[D];浙江大學(xué);2007年

8 呂慶國(guó);大鼠胰島β細(xì)胞分離與培養(yǎng)的初步研究[D];四川大學(xué);2007年

本文編號(hào)：2656665