【摘要】：新生隱球菌是具莢膜的酵母類(lèi)真菌，可以引起免疫受損患者的隱球菌病。 它分為5個(gè)血清型：A，B，C，D，AD。為了區(qū)分那些在形態(tài)上和生理上不能 區(qū)分的菌體，需要一種穩(wěn)定和敏感的遺傳標(biāo)記，這種標(biāo)記可以鑒定不同的血清 型并能判斷感染的復(fù)發(fā)和再感染。本研究旨在對(duì)新生隱球菌的分子生物學(xué)分類(lèi) 方法進(jìn)行初步的研究，研究?jī)?nèi)容包括(1)新生隱球菌原生質(zhì)體形成和DNA抽 提方法的研究：(a)新生隱球菌菌原生質(zhì)體形成條件的研究：原生質(zhì)體的形成是 制備核酸和細(xì)胞器如線粒體的重要工具，為了建立原生質(zhì)體形成的條件，我們 在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用了不同的酶(溶壁酶和 NovoZyme234)、不同的酶濃度 (1，3，5mg/ml)、不同的pH值(4，5，6，7，8)和不同的滲透壓穩(wěn)定劑(蔗糖、 甘露醇和山梨醇)，結(jié)果顯示對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期的細(xì)胞較易形成原生質(zhì)體，原生質(zhì)體 形成的最佳條件是以 0．8M的山梨醇為滲透壓穩(wěn)定劑，pH 6.0，5 mM DTT，， 3mg／ml NovoZyme 234，孵育 75分鐘，在此條件下，原生質(zhì)體的產(chǎn)量是 98．1％。 溶壁酶的結(jié)果與 NovoZyme 234相似。(b)線粒體 DNA的快速抽提和電鏡觀 察：為了建立新生隱球菌線粒體DNA快速抽提方法并分析其形態(tài)學(xué)特征，我 們選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用NovoZym234和機(jī)械破壁，通過(guò)差速離心的方法 抽提線粒體DNA，并用電鏡檢查了實(shí)驗(yàn)中所獲得的菌體、原生質(zhì)體、線粒體三 部分沉淀，用此法可以得到20μg純凈的mtDNA，由此而建立了一種簡(jiǎn)單快速 的新生隱球菌線粒體 DNA抽提方法。(c)新生隱球菌基因組 DNA的快速抽 提法的建立和不同抽提方法的比較；DNA是進(jìn)行分子生物學(xué)研究的重要基礎(chǔ)。 在本研究中，我們建立了兩種簡(jiǎn)單快速的抽提基因組DNA的方法并可用作PCR 擴(kuò)增的模板，通過(guò)比較四種不同的DNA抽提方法以確定哪種更適合進(jìn)行下一 步的基因分析，這四種方法是：玻璃珠法，酶法，3％SDS法和氯化芐法。玻璃 珠法是用玻璃珠在混漩器上劇烈振蕩破碎細(xì)胞壁；3％SDS法是將細(xì)胞在含 10mM DTT的3％SDS溶液中加熱，然后用 5MKSc和異丙醇抽提，DNA的 產(chǎn)量通過(guò)A260測(cè)定。結(jié)果顯示：玻璃珠法是最敏感、重復(fù)性好、簡(jiǎn)單、費(fèi)用 合理的抽提方法。(2)新生隱球菌5種血清型的CAP64基因的序列分析：多 。糖莢膜是新生隱球菌的重要的毒性因子，應(yīng)用莢膜多糖抗原可以進(jìn)行新生隱球 二 論文：新生隱球菌分于生物學(xué)分類(lèi)方法的研究 菌的血清分型。本研究分析了5種血清型的CAP64基因的序列的相似性，我 0 們擴(kuò)增了CAP64基因一個(gè)約550hp的DNA序列，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后克隆到T 載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌JM109株中，通過(guò)PCR鑒定陽(yáng)性克隆并測(cè)序，5種 血清型 CAP64序列的比較顯示其間的堿基差異為 61～glbp，相fi；(，’．’為 83．75％～ 88．03％，其核酸序列的差異是多位點(diǎn)的，生要在 227hp～23 fop之間；氨基酸 的分析結(jié)果與此類(lèi)似。(3)新生隱球菌的AFLP分析：AFLP己經(jīng)被確認(rèn)是一 種重復(fù)性好、結(jié)果可靠的DNA指紋技術(shù)，在本研究中，我們將AFLP技術(shù)首 次應(yīng)用于新生隱球苗中并獲得了良好的結(jié)果，新生隱球菌基因組DNA用雙酶 酶切，雙鏈接頭連于其酶切末端，用與接頭和酶切位點(diǎn)互補(bǔ)的引物擴(kuò)增DNA 片段，其產(chǎn)物在高分辨的變性聚丙酞胺凝膠上電泳分離，然后進(jìn)行銀染，分析 已 來(lái)自 5種血清型和臨床分離株的 18株新生隱球菌，可見(jiàn)有 30多條大小在 30． 500hP的 DNA－AFLP指紋，相同的血清型有不同的指紋圖譜，來(lái)自同一患者不 同病期的兩株分離株和來(lái)自同一患者患者的不同部位的兩株分離株都顯示出相 同的帶型，結(jié)果顯示了AFLP的高分辨率，它是能提高我們對(duì)新生隱球菌認(rèn)識(shí) 的強(qiáng)有力的流行病學(xué)工具。
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2001
【分類(lèi)號(hào)】：R379.5

【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 張園;王靜梅;剡根強(qiáng);;新生隱球菌病研究進(jìn)展[J];動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2007年12期

本文編號(hào)：2656535