【摘要】：目的： 內(nèi)皮損傷是動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗死、經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療術(shù)后支架內(nèi)再狹窄、下肢動(dòng)脈硬化閉塞癥（PAD）、休克等各種血栓性疾病的始動(dòng)病因。促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞（EC）的完整性，維持其正常功能，將為此類疾病提供新的防治手段。本研究探討了一個(gè)新近發(fā)現(xiàn)的調(diào)控細(xì)胞轉(zhuǎn)錄的基因——E1A激活基因阻遏子（CREG）調(diào)控人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）周期的作用和機(jī)制，并在小鼠下肢缺血模型中初步探討了其對(duì)血管新生的影響。 方法： （1）以綠色熒光蛋白（GFP）腺病毒感染HUVEC作為對(duì)照，應(yīng)用CREG腺病毒使HUVEC過表達(dá)CREG，以細(xì)胞計(jì)數(shù)、BrdU摻入實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)CREG對(duì)HUVEC增殖的影響，Western blot檢測(cè)HUVEC中CREG、信號(hào)通路、細(xì)胞周期蛋白（Cyclins）及細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（CDKs）的表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)Cyclins在轉(zhuǎn)錄水平上的表達(dá)差異。（2）以表達(dá)短發(fā)卡RNA （shRNA）序列的陰性空載體為對(duì)照，將CREG表達(dá)沉默的shRNA載體轉(zhuǎn)染至逆轉(zhuǎn)錄病毒，產(chǎn)生病毒后感染HUVEC，經(jīng)嘌呤霉素篩選，得到CREG表達(dá)下調(diào)的HUVEC；應(yīng)用細(xì)胞計(jì)數(shù)、BrdU摻入實(shí)驗(yàn)、FCM檢測(cè)從功能缺失角度驗(yàn)證CREG下調(diào)對(duì)HUVEC增殖的影響。（3）根據(jù)信號(hào)通路Western blot結(jié)果的提示，應(yīng)用信號(hào)通路阻斷劑阻斷可被CREG明顯影響的信號(hào)通路，以BrdU摻入實(shí)驗(yàn)及FCM檢測(cè)細(xì)胞增殖并確定CREG發(fā)揮生物學(xué)作用的通路，Westernblot檢測(cè)蛋白表達(dá)及信號(hào)通路蛋白及Cyclins的表達(dá)，確定CREG相關(guān)的信號(hào)通路及Cyclins。（4）在腺病毒感染造成CREG過表達(dá)的HUVEC中使用血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子中和抗體（VEGF NA）阻斷VEGF的作用；在CREG被干擾造成其表達(dá)下調(diào)的HUVEC中添加重組人血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（rhVEGF165），以細(xì)胞計(jì)數(shù)、BrdU摻入試驗(yàn)、FCM檢測(cè)細(xì)胞增殖，同時(shí)以Western blot檢測(cè)信號(hào)通路以及Cyclins的表達(dá)，確定血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是否參與了CREG調(diào)控HUVEC增殖及Cyclins表達(dá)的作用。（5）以正常的以及感染GFP腺病毒的HUVEC作為對(duì)照，應(yīng)用體外及小鼠在體matrigel血管生成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HUVEC感染CERG腺病毒后對(duì)血管生成的影響；制作小鼠下肢缺血模型后，以PBS、GFP腺病毒做為對(duì)照，應(yīng)用CREG腺病毒感染局部缺血肌肉組織，觀測(cè)術(shù)肢體溫、自體截肢率，以病理切片觀測(cè)肌纖維形態(tài)改變，應(yīng)用血流灌注成像儀檢測(cè)術(shù)肢/健肢灌注比，檢測(cè)CREG對(duì)小鼠下肢缺血的治療作用以及對(duì)血管新生的影響。 結(jié)果： （1）與對(duì)照組相比，HUVEC經(jīng)腺病毒感染過表達(dá)CREG后，細(xì)胞計(jì)數(shù)增多，BrdU摻入實(shí)驗(yàn)中BrdU陽性細(xì)胞百分比增多，F(xiàn)CM分析提示S+G2期占全部細(xì)胞比例增多；而在shRNA導(dǎo)致CREG表達(dá)下調(diào)后，與對(duì)照組相比，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞計(jì)數(shù)減少，BrdU陽性細(xì)胞百分比減少，F(xiàn)CM分析可見S+G2期占全部細(xì)胞比例減少。（2）Wstern blot提示：與對(duì)照組相比，CREG可使ERK、PI3K/Akt信號(hào)通路激活，Cyclin E表達(dá)增多，RT-PCR發(fā)現(xiàn)CREG可在轉(zhuǎn)錄水平影響Cyclin E的表達(dá)。（3）信號(hào)通路阻斷劑添加后，BrdU摻入實(shí)驗(yàn)及FCM檢測(cè)提示：盡管PI3K/Akt、ERK信號(hào)通路都可影響CREG調(diào)控的HUVEC增殖，但ERK通路特異性的介導(dǎo)了CREG對(duì)HUVEC增殖的調(diào)控，，Western blot檢測(cè)也證實(shí)了ERK特異性的介導(dǎo)了CREG對(duì)Cyclin E的調(diào)控。（4）體外及在體matrigel血管生成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CREG過表達(dá)可使毛細(xì)血管密度明顯增多；小鼠下肢缺血模型制作成功后，以腺病毒感染缺血區(qū)肌肉組織，經(jīng)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)CREG的腺病毒感染組與PBS組以及GFP腺病毒相比，術(shù)肢體溫升高、自體截肢率降低、病理切片提示肌纖維萎縮程度明顯減輕，血流灌注成像儀檢測(cè)結(jié)果提示與對(duì)照組相比，CREG過表達(dá)組術(shù)肢/健肢灌注比升高。 結(jié)論： （1）CREG可促進(jìn)體外培養(yǎng)HUVEC的增殖；（2）ERK/Cyclin E通路介導(dǎo)了CREG對(duì)HUVEC增殖的調(diào)控作用；（3）CREG過表達(dá)能促進(jìn)小鼠缺血下肢的血管新生。本研究為PAD的治療提供了一個(gè)新的靶點(diǎn)，也為CREG在缺血性心肌病、經(jīng)皮冠脈內(nèi)介入治療術(shù)后支架內(nèi)再狹窄及遲發(fā)性血栓的防治中的應(yīng)用提供了新的證據(jù)。
【圖文】：

組以及 HUVEC 組相比有 CREG 表達(dá)明顯增多，而對(duì)照組（HUVEC-GFP 組）與正常組（HUVEC 組）相比無明顯差異（圖 2-1B）。圖2-1 腺病毒感染HUVEC的效率以及Western blot檢測(cè)CREG表達(dá)情況A. HUVEC-AdCREG組以及HUVEC-GFP組經(jīng)相應(yīng)腺病毒感染72h后感染率均在90%以上。a.光鏡下HUVEC-AdGFP組細(xì)胞圖像；b.熒光顯微鏡下HUVEC-AdGFP組細(xì)胞發(fā)出熒光，感染率90%以上；c.光鏡下HUVEC-AdCREG組細(xì)胞圖像；d.熒光顯微鏡下HUVEC-AdCREG組細(xì)胞發(fā)出熒光，感染率90%以上。B. Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞CREG表達(dá)情況。上圖：Western blot 提示HUVEC-AdCREG組細(xì)胞CREG表達(dá)明顯增多；下圖：灰度半定量分析（以β-tubulin作為內(nèi)參，CREG/β-tubulin灰度比作為數(shù)值進(jìn)行比較）提示HUVEC組（0.62±0.04）與HUVEC-AdGFP組（0.58±0.06）之間CREG的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（NS: no significance），HUVEC-AdCREG組（3.60±0.37）與HUVEC、HUVEC-AdGFP間相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（**p＜0.01, n=3）。2）CREG過表達(dá)可促進(jìn)原代培養(yǎng)的HUVEC的增殖。HUVEC經(jīng)CREG腺病毒感染后，經(jīng)細(xì)胞計(jì)數(shù)、BrdU摻入試驗(yàn)及FCM檢測(cè)分析，與正常HUVEC及HUVEC-AdGFP對(duì)照組相比，HUVEC-AdCREG組在培養(yǎng)第3d細(xì)胞數(shù)量明顯增多（162.7±10.5×105vs 130.7±6.7×105vs 135.7±6.0×105

第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文25胞比例顯著增高（64.3±5.1% vs 49.3±5.1% vs 51.7±6.8%，圖2-2B）、S+G2期細(xì)胞百分比顯著增高（65.0±2.6% vs 43.3±1.5% vs 44.0±1.0%，圖2-2C），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，HUVEC組與HUVEC-AdGFP組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果表明CREG過表達(dá)可促進(jìn)HUVEC的增殖。圖2-2 細(xì)胞計(jì)數(shù)、BrdU摻入實(shí)驗(yàn)、FCM分析檢測(cè)CREG過表達(dá)對(duì)HUVEC增殖的影響A．細(xì)胞計(jì)數(shù)：三組細(xì)胞各取2×105連續(xù)培養(yǎng)72h，每24h計(jì)數(shù)，結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析提示：HUVEC-AdCREG組（162.7±10.5×105）與HUVEC（130.7±6.7×105）、HUVEC-AdGFP（135.7±6.0×105）組相比，生長(zhǎng)至72h時(shí)計(jì)數(shù)結(jié)果差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（** p＜0.01, n=3），HUVEC與HUVEC-AdGFP組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。B．BrdU摻入試驗(yàn)：結(jié)果提示BrdU陽性細(xì)胞百分比在HUVEC-AdCREG組（64.3±5.1%）與HUVEC組（49.3±5.1%）、HUVEC-AdGFP（51.7±6.8%）組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（* p＜0.05,n=3 ），HUVEC與HUVEC-AdGFP組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（NS: no significance）。C．FCM檢測(cè)：HUVEC-AdCREG組S+G2期細(xì)胞百分比（65.0±2.6%）與HUVEC（43.3±1.5%）、HUVEC-AdGFP（44.0±1.0%）組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*** p＜0.001, n=3）
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R54;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2656002