【摘要】：有機(jī)磷化合物水解酶是廣泛存在于多種生物體內(nèi)的一類酯酶,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明肝臟中含有豐富的有機(jī)磷化合物水解酶活性,它對(duì)有機(jī)磷化合物的高效水解作用已引起人們的極大的興趣。本課題選擇人肝為材料,對(duì)人肝中的梭曼水解酶的測(cè)定方法、生化性質(zhì)、序列同源性等進(jìn)行了研究,主要結(jié)果如下: 建立了人肝梭曼水解酶的氟電極測(cè)定方法:人肝梭曼水解酶可催化梭曼水解,梭曼水解后釋放出游離氟離子(F~-),氟離子電極可直接測(cè)得F~-濃度,在毫伏計(jì)上以電勢(shì)值顯示,因而可以測(cè)量酶的催化活性。 依次用超速離心、中空纖維超濾法(30KD,150KD)、制備性平板等電聚焦、Sephadex G-50柱、Sephadex G-75柱、DEAE-Sepharose CL 6B連續(xù)性梯度層析、Sephacryl-200 HR柱層析等步驟對(duì)人肝梭曼水解酶的進(jìn)行了純化。SDS-PAGE電泳鑒定顯示為單一條帶。人肝梭曼水解酶被純化213倍,比活力達(dá)到1070 n mol soman/min/mg protein。 純化的人肝梭曼水解酶的生化性質(zhì)研究表明其分子量為36KD(SDS-PAGE);氨基酸組份分析發(fā)現(xiàn)人肝中梭曼水解酶是含堿性氨基酸較多的一種蛋白。通過(guò)肽指紋圖譜信息在數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜(ESI-MS/MS)與HPLC聯(lián)用獲得了準(zhǔn)確性很高的三個(gè)肽段序列,其提供的氨基酸信息經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索鑒定結(jié)果都表明是一種未知蛋白。 純化的人梭曼水解酶的三個(gè)肽段與不同種屬梭曼水解酶進(jìn)行多序列比較,發(fā)現(xiàn)梭曼水解酶與魷魚型的DFP酶之間具有很高的序列相似性。BLAST檢索結(jié)果表明人梭曼水解酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)與鈣調(diào)蛋白有一定相似性;Swiss-Protsite位點(diǎn)檢索結(jié)果進(jìn)一步表明位于第二肽段的DGDGDGYLSAAELR序列是鈣結(jié)合位點(diǎn),這段序列與Squid-Type DFPase保守序列具有相似性,且位于第二肽段的DGDGDGDGY序列也是酪氨酸激酶磷酸化位點(diǎn),計(jì)算機(jī)模擬二者的空間結(jié)構(gòu)也具有很高的相似性,位于第三肽段GTLTTK的序列是�；稽c(diǎn)。 根據(jù)我們得到的部分序列與Squid-type DFPase序列的比較以及報(bào)道的Squid-type DFPase的活性位點(diǎn),我們提出人的梭曼水解酶的催化機(jī)制可能如下: 1.底物梭曼進(jìn)入梭曼水解酶活性位點(diǎn)中,磷�；难�(=O)
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號(hào)】：Q55

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1 劉敏;梭曼水解酶的分離純化及其活性位點(diǎn)部分序列研究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2002年

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本文編號(hào)：2656000