【摘要】：干擾素（Interferon）是一組具有廣泛生物學(xué)活性，包括抗病毒、抗腫瘤以及免疫調(diào)節(jié) 活性的細(xì)胞因子，在臨床上具有很廣闊的應(yīng)用前景。目前國內(nèi)基因工程人IFN-β的研制 工程尚未達(dá)到產(chǎn)業(yè)化水平。本研究應(yīng)用新型表達(dá)測序一體化載體pLCM182，構(gòu)建了表 達(dá)重組人突變型IFN-β（~(17)Ser-IFN-β）的原核表達(dá)載體，導(dǎo)入大腸桿菌后經(jīng)反復(fù)篩選到， 得到穩(wěn)定高效表達(dá)~(17)Ser-IFN-β的工程菌；通過優(yōu)化了~(17)Ser-IFN-β程菌的發(fā)酵表達(dá)條 件，使其可以滿足中試生產(chǎn)的要求；另外經(jīng)過反復(fù)實(shí)驗(yàn)，完成了基因工程~(17)Ser-IFN-β 的純化工藝研究，連續(xù)三批制品檢定結(jié)果表明其質(zhì)量己達(dá)到生物制品規(guī)程的相關(guān)要求， 并已通過國家藥品及生物制品檢定所的質(zhì)量鑒定。 另外，本研究還通過大規(guī)模測序從人樹突狀細(xì)胞cDNA文庫中克隆到一種編碼新型 干擾素樣細(xì)胞因子（IFN-CK）的全長新基因。生物信息學(xué)分析結(jié)果表明，IFN-CK含有Ⅰ 型干擾素家族特征性標(biāo)鑒序列，與IFN-α及IFN-β具有較高的同源性。Northern印跡分 析結(jié)果表明，IFN-CK在腎、心臟、骨骼肌、肝和胰腺、胎盤、睪丸、卵巢、外周血白 細(xì)胞、結(jié)腸和肺等組織中均未檢測到明顯的表達(dá)。RT-PCR結(jié)果表明，該基因相對特 異地表達(dá)于樹突狀細(xì)胞。 初步生物學(xué)功能研究結(jié)果表明，IFN-CK無明顯的抗病毒活性，但可抑制亞適劑量 PHA刺激的PBMNC增殖反應(yīng)及IL-2的分泌，抑制T細(xì)胞表面CD45RO及IL-2受體 的表達(dá)，表明該新型干擾素樣細(xì)胞因子可能作為樹突狀細(xì)胞特異性分泌的活性分子對機(jī) 體的免疫功能起調(diào)節(jié)作用。 干擾素（Interferon，IFN）是一組具有廣泛生物學(xué)活性，包括抗病毒、抗腫瘤以及 免疫調(diào)節(jié)活性的細(xì)胞因子。IFN是最早發(fā)現(xiàn)、研究最多、也是第一個(gè)被用于臨床治療 疾病的細(xì)胞因子。根據(jù)干擾素的蛋白質(zhì)的氨基酸結(jié)構(gòu)、抗原性和細(xì)胞來源，可將其分 為三大類：IFN-α、IFN-β和IFN-γ，其中IFN-α主要由白細(xì)胞產(chǎn)生，IFN-β主要由 成纖維細(xì)胞產(chǎn)生，兩者均具有相似的生物學(xué)活性，結(jié)合同樣的細(xì)胞表面受體，統(tǒng)稱為 Ⅰ型干擾素。IFN-γ主要由T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，其抗病毒活性較弱，但免疫調(diào)節(jié)作用強(qiáng)， 因此也被稱為免疫干擾素或Ⅱ型干擾素。 自從IFN-β被發(fā)現(xiàn)以來，研究人員最先是從成纖維細(xì)胞通過病毒誘導(dǎo)后制備天 然的IFN-β，在對IFN-β進(jìn)行了廣泛的基礎(chǔ)研究后，已將其試用于多發(fā)性硬化癥、 腫瘤、及多種病毒性感染的治療。天然的人IFN-β是一種糖基化蛋白，但天然來源 的IFN-β生產(chǎn)工藝比較復(fù)雜，來源比較困難而且成本較高，限制了IFN-β臨床研究 和應(yīng)用。隨著重組DNA技術(shù)的迅速發(fā)展，研究人員克隆了IFN-β的基因并成功地進(jìn) 行了表達(dá)。目前國外多家研究機(jī)構(gòu)已經(jīng)在成功地大腸桿菌、酵母菌、哺乳動物細(xì)胞中 進(jìn)行了IFN-β的穩(wěn)定、高效表達(dá)，基因工程人 IFN-β已于 1993年通過 FDA批準(zhǔn)用 于多發(fā)性硬化癥的治療。 由于互型干擾素對臨床上多種疾病具有顯著的治療，因此國外己廣泛開展了該方 面的研制及臨床研究工作，而國內(nèi)干擾素的研制和應(yīng)用多集中于D’i－a，除了IFN－ 第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 中文摘要 a fo為我國自行發(fā)現(xiàn)外，大多數(shù)的工作均屬于跟蹤性研究。最近我們通過大規(guī)模隨 機(jī)測序，從人樹突狀細(xì)胞。DNA文庫中發(fā)現(xiàn)了一條編碼一種千擾素樣細(xì)胞因子 門nterferondike cytokine，fN－CK）的新基因，因此我們在完成了重組人突變型 fN－ p工程菌的構(gòu)建、表達(dá)及純化工藝的研究基礎(chǔ)上（第一部分），進(jìn)一步探討了該新型 干擾素樣細(xì)胞因子基因的組織分布及其生物學(xué)功能（第二部分）。 第一部分 基因工程人 IFN平工程菌的構(gòu)建、表達(dá)純化 雖然國內(nèi)WN一p的研制工作雖然已開展多年，但至今仍未達(dá)到產(chǎn)業(yè)化，也未被 國家藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)開展臨床試驗(yàn)研究。究其原因，主要是因?yàn)樵贗FN一B的研 制過程中，許多生產(chǎn)工藝限制了其研制的進(jìn)程。其中包括WN一p的原核表達(dá)量，發(fā) 酵條件、復(fù)性條件及隨后的IFN一p的純化工藝等。 人 UN個(gè)由 165個(gè)氨基酸殘基組成，其中含 3個(gè)半耽氨酸，分別位于第 17、31 和141位，第引位與第141位的半瞇氨酸將形成二硫鍵，對其發(fā)揮生物學(xué)活性不可 缺少。在原核表達(dá)過程中，，第17位半眺氨酸的存在會影響隨后復(fù)性過程中蛋白質(zhì)內(nèi) 二硫鍵的正確形成，從而降低產(chǎn)品生物學(xué)活性。因此我們將其突變?yōu)榻z氨酸，表達(dá)一 種新型的 17位絲氨酸的 IFN乃（’飛er側(cè)小卜在本部分研究中，我們采用 RT—PCR 方法從骨髓基質(zhì)細(xì)胞中克隆了了人 UN’＊ 6的 cDNA，并將第 17位編碼半耽氨酸序列 突變?yōu)榫幋a絲氨酸的序列，構(gòu)建了高效原核表達(dá)載體、通過優(yōu)化工程菌的發(fā)酵條件、 建立‘七er DNLDNL D的穩(wěn)定高效的原核表達(dá)體系，并摸索了一種適合于后續(xù)中試生產(chǎn)應(yīng) 用的重組蛋白質(zhì)純化工藝。 取體外培養(yǎng)的人骨髓基質(zhì)細(xì)?
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2001
【分類號】：R346

【引證文獻(xiàn)】

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1 曲嘉琪;李洋;鐘一鳴;蔡梅紅;;β干擾素及其研究進(jìn)展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2013年09期

本文編號：2651642