【摘要】：促肝細胞生長素(pHGF)是按LaBrecque從大鼠再生肝中提取肝細胞刺激因子(HSS)的方法，從乳豬肝中提取的一種促進肝細胞生長的活性物質，其作用與HSS近似。為了更深入了解HSS或pHGF的生物學性能及作用機理，本實驗進行了以下的研究工作：(1)觀察pHGF對人皮膚成纖維細胞(HSF)及大鼠肝星狀細胞(HSC-T6)增殖的影響。(2)了解pHGF對HSF，HSC-T6產生細胞外基質(ECM)如透明質酸(HA)，Ⅰ型膠原(COLI)等的作用，探討pHGF在分子生化水平上的作用機制。(3)在已有報道α_1(Ⅰ)膠原基因啟動子活性的基礎上，觀察pHGF對啟動子活性的影響，進一步研究pHGF在基因轉錄水平上的作用。 第一部分 促肝細胞生長素對人正常皮膚成纖維細胞及 大鼠肝星狀細胞增殖的影響 肝實質細胞與肝間質細胞(如肝星狀細胞，枯否細胞等)一直是肝纖維化復雜的病理過程中的研究熱點。已有報道pHGF在大鼠肝纖維化模型中，對肝纖維化有阻斷及保護作用。為了觀察pHGF的細胞學作用，本實驗選擇人皮膚成纖維細胞(HSF)與大鼠肝星狀細胞(HSC-T6)為體外細胞模型進行研究，觀察了pHGF對HSF，HSC-T6細胞增殖的影響。 HSF取自一3歲幼兒因手部燒傷后疤痕形成而需植皮的腹部正常 皮膚組織，按常規(guī)組織貼塊法培養(yǎng)。HSC一。引自德國亞深RWTH大學 醫(yī)院中心實驗室。用培養(yǎng)基倍比稀釋pHGF并調整終濃度至62.5，125， 250，500，1000協g/ml。取對數生長期培養(yǎng)細胞HSF，HSC一T6，調整 細胞密度為lxl05個/m1，接種于%孔板24小時后，分別加入不同濃 度pHGF，孵育24小時，進行MTT試驗，檢測55Onm0D值。結果顯示: (1)pHGH在500 ug/ml，1000 pg/ml濃度組，對HSF細胞增殖有明 顯抑制作用，與對照組相比較差異顯著(P0.001)。而在低于250協 g/ml濃度組，pHGF對HSF細胞增殖的抑制作用不明顯，，與對照組比 較無顯著差異。(P0.05)。(2) pHGF對HsC一T6細胞增殖在各濃度組 均有明顯的抑制作用，與對照組比較有明顯差異(P0.01)。其抑制 增殖的起始作用濃度較對HSF的增殖抑制起始作用濃度要低，在62.5 協g/m1即產生明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性改變。 本實驗觀察到pHGF對HSF，HSC一T。細胞的增殖均有不同程度的 抑制作用。本實驗還摸索了pHGF對HSF，HSC一T6細胞增殖抑制的濃 度梯度，為選擇合適的亞適劑量濃度進一步研究pHGF在分子生化水 平以及基因水平上的作用奠定了基礎。 第二部分促肝細胞生長素對人正常皮膚成纖維細胞和大鼠肝星狀 細胞產生細胞外基質的影響 細胞外基質(EX七racellular matrix，ECM)在 DISSe間隙內的 過量沉積是形成肝纖維化的主要病理基礎。ECM成分復雜，主要含膠 原蛋白，結構糖蛋白，多糖類物質等。在各型膠原蛋白中，Lm型膠 原是纖維化肝或硬化肝的主要成分，分別約占6070，2070。透明質酸 (hyaluroniC aCid，HA)是ECM中最重要的糖胺多糖，其與其它糖 胺多糖(Glyosamin。glycan，GAG)協同構成蛋白聚合體。肝纖維化 時，肝星狀細胞合成HA水平大大升高，且內皮細胞清除隊能力下降。 HA在肝纖維化致病過程中的作用已得到廣泛認同，是目前眾多肝纖 維化生化指標中較為敏感和特異的指標。本實驗以工型膠原 (collagen工，c0L工)和透明質酸(HA)為代表研究促肝細胞生長素 (pHGF)對HSF、HSC一T6細胞產生ECM的影響。HSF、HSC一T6細胞培 養(yǎng)方法按第一部分所述進行。細胞密度lx105個/ml，按每孔2ml密度 接種6孔板，24小時后，將新鮮配制的pHGF分別以200 pg/ml，400 pg/ml的濃度加入6孔板，繼續(xù)培養(yǎng)24小時，取細胞上清液，進行 I型膠原(COL工)、透明質酸(HA)放免分析檢測。結果顯示:(1) pHGF在200 pg/ml及400拼g/ml濃度組，對HSF產生HA均具有明顯 的抑制作用，與對照組相比，差異非常顯著(P0.01);pHGF在200 乒g/ml濃度組對HSF產生COLI的抑制作用不明顯(P0.05)，當濃 度增加至400 pg/耐時，抑制HSF產生COLI的作用明顯，與對照組 比較差異顯著(P0.05)。(2)pHGF在200且g/ml濃度組對HSC一T6 細胞產生HA的抑制作用不明顯，與對照組比較，無明顯差異 (P0.05)，當增加濃度至 400協g/m1時對HA產生的抑制作用明顯增 加，與對照組比較差異顯著(p0.05)。因檢測試劑的種屬特異性， 用人工型膠原放免試劑盒在大鼠肝星狀細胞(HSC一T6)上清液中未 檢出COL工O 本實驗在pHGF對HSF，HSC一T。細胞增殖抑制的基礎上，又進一步 觀察到pHGF對HSF，HSC一T6細胞產生HA及COLI的抑制作用。結合 前兩部分實驗分析，pHGF的作用不僅發(fā)生在對細胞增殖抑制的細胞 水平上，而且在細胞產生ECM的分子生化水平存在調控作用。至于這 種調控抑制的機理目前尚不清楚，本課題將在第三部分進一步從基因 轉錄水平探討pHGF的作用機理以及pHGF抑制COLI基因表達的作用 機制。 第三部分促肝細胞生長素對“1(I)膠原基因 啟動子活性的影響 在肝腎及皮膚等器官發(fā)生慢性炎癥時，以COLI為主的膠原蛋白 大量合成，是器官纖維化病理機制中的重要環(huán)節(jié)。COLI由兩條a:鏈 和一條QZ鏈組成，其合成主要由轉錄機制介導。人COLI基因上游5’ 側翼區(qū)約200一40Obp的序列中
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2003
【分類號】：R346

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