【摘要】：目的 1.建立HBV復(fù)制小鼠模型并研究HBV清除的免疫學(xué)機(jī)制。 2.了解MCMV和HBV先后感染/復(fù)制的相互影響及其機(jī)制。重點(diǎn)研究合并CMV感染對(duì)HBV感染轉(zhuǎn)歸的影響。 材料和方法 1.將10ug腺病毒載體構(gòu)建的HBV表達(dá)質(zhì)粒pAAV/HBV1.2經(jīng)尾靜脈高壓水注射入不同來源的6-8周的雄性C57BL/6小鼠(Harla、DEREG、ZTL、Charles River)體內(nèi),監(jiān)測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)血清HBsAg清除情況。 2.分別將2ug、5ug、10ugpAAV/HBV1.2經(jīng)尾靜脈高壓水注射入三組Harlan小鼠,監(jiān)測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)血清HBsAg清除情況。 3.將10ugpAAV/HBV1.2及其HBV核心區(qū)截短的突變體(HBc150、HBc175)以及質(zhì)粒骨架和HBV序列長(zhǎng)度均不同于pAAV/HBV1.2的質(zhì)粒pSM2分別經(jīng)尾靜脈高壓水注射入3組Harlan小鼠體內(nèi)。監(jiān)測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)血清HBsAg清除情況。采用細(xì)胞內(nèi)IFNγ染色結(jié)合細(xì)胞表面染色技術(shù)檢測(cè)Harlan小鼠在分別轉(zhuǎn)染pAAV/HBV1.2和pSM2后不同時(shí)間點(diǎn)外周血單個(gè)核細(xì)胞中HBV特異的T細(xì)胞的數(shù)量。 4.將10ug的pAAV/HBV1.2經(jīng)尾靜脈高壓水注射入Harlan小鼠,6周后經(jīng)腹膜內(nèi)注射100ul含5×104PFU的MCMV病毒。檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)血清HBsAg水平。在MCMV感染1周后制備脾臟淋巴細(xì)胞懸液用于檢測(cè)MCMV及HBV特異性T細(xì)胞。勻漿肝臟組織,收集上清采用病毒空斑試驗(yàn)檢測(cè)MCMV的滴度。 5.分別對(duì)HBV和MCMV免疫的脾臟和肝臟細(xì)胞作細(xì)胞內(nèi)因子染色和抗原肽包被的H-2b二聚體和五聚體染色,以檢測(cè)HBV與MCMV之間是否存在交叉免疫細(xì)胞。 6.將100ul含1×105PFU MCMV的PBS經(jīng)腹膜內(nèi)注射入Harlan小鼠體內(nèi),6周后經(jīng)尾靜脈高壓水注射10ug pSM2質(zhì)粒。檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)血清HBsAg水平。pSM2注射后16天制備脾臟淋巴細(xì)胞懸液用于檢測(cè)MCMV及HBV特異性T細(xì)胞及NK細(xì)胞、Treg細(xì)胞的頻率。勻漿肝臟組織,收集上清采用病毒空斑試驗(yàn)檢測(cè)MCMV的滴度。 7.分別采用針對(duì)NK細(xì)胞、CD8細(xì)胞以及INF-γ的單克隆抗體在pSM2轉(zhuǎn)染小鼠前后經(jīng)腹膜內(nèi)注射入小鼠體內(nèi)。監(jiān)測(cè)血清HBsAg水平及HBV特異性T細(xì)胞應(yīng)答強(qiáng)弱的變化。 結(jié)果 1.不同來源的C57BL/6J小鼠在pAAV/HBV1.2轉(zhuǎn)染后1天可檢測(cè)到血清中HBsAg分泌,第4天到1周達(dá)到最高峰,隨后逐漸下降,所有Harlan小鼠和DEREG小鼠血清HBsAg分別于第6周和第7周下降至檢測(cè)限以下。而50%的ZTL小鼠及Charles River小鼠HBsAg血癥持續(xù)到8周以后。 2.三組分別轉(zhuǎn)染了2ug、5ug、10ugpAAV/HBV1.2的Harlan小鼠均在質(zhì)粒注射后5周內(nèi)清除了HBsAg血癥,清除過程沒有顯著性差別。 3.75%轉(zhuǎn)染pAAV/HBV1.2的Harlan小鼠在質(zhì)粒注射后4周內(nèi)清除血清中的HBsAg,而66%轉(zhuǎn)染HBc150及HBc175的小鼠分別在質(zhì)粒注射后第3周和5周清除血清中的HBsAg o所有轉(zhuǎn)染pSM2的小鼠在注射質(zhì)粒后2周內(nèi)HBsAg血癥消失。 4.pSM2轉(zhuǎn)染后第2周起,在Harlan小鼠PBMC中即可檢測(cè)到針對(duì)HBcAg和HBsAg的特異性免疫應(yīng)答,其中針對(duì)HBcAg的免疫應(yīng)答顯著高于HBsAg。而在pAAV/HBV1.2及其衍生質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的小鼠PBMC中未檢測(cè)到HBV特異性免疫應(yīng)答。 5.急性HBV清除后的小鼠和未經(jīng)免疫的小鼠在感染急性MCMV后產(chǎn)生MCMV特異性的T細(xì)胞數(shù)量以及肝臟中MCMV的病毒含量無顯著性差別。急性HBV感染后第7周,血清中HBsAg清除后第2周,在MCMV感染的小鼠而非HBV轉(zhuǎn)染小鼠的脾臟中檢測(cè)HBV抗原的特異性T細(xì)胞應(yīng)答。采用抗原肽包被的H-2b二聚體和五聚體染色技術(shù)在MCMV免疫的脾臟細(xì)胞中檢測(cè)到能同時(shí)與HBV抗原肽C1與MCMV抗原肽M57反應(yīng)的T細(xì)胞,在HBV免疫的脾細(xì)胞中則未檢測(cè)到,說明這種交叉免疫具有單向性。 6.持續(xù)性MCMV感染或未經(jīng)免疫的Harlan小鼠轉(zhuǎn)染pSM2后,其血清HBsAg水平迅速上升,4天后達(dá)到最高峰,以后逐漸下降。持續(xù)性MCMV感染的小鼠血清HBsAg清除較緩慢,血清HBsAg水平在轉(zhuǎn)染pSM2后第9、11天均高于未經(jīng)免疫的小鼠。在9天時(shí)有顯著性差異。轉(zhuǎn)染pSM2后,兩組小鼠未檢測(cè)到巨噬細(xì)胞(F4/80) MHC表達(dá)量的顯著差異。但是在持續(xù)性MCMV感染的小鼠中產(chǎn)IFNy的HBV C1特異性T細(xì)胞及NK細(xì)胞顯著高于未經(jīng)免疫的小鼠。清除或封閉NK細(xì)胞或EFNγ均可增加血清HBsAg水平,同時(shí)封閉IFNy還可減低HBV特異性T細(xì)胞數(shù)量。另外轉(zhuǎn)染pSM2后,持續(xù)性MCMV感染小鼠脾臟和肝臟內(nèi)Treg細(xì)胞數(shù)量顯著高于未經(jīng)免疫的小鼠。 7.持續(xù)性MCMV感染的小鼠轉(zhuǎn)染pSM2后,其脾臟中針對(duì)MCMV特異性的T細(xì)胞數(shù)量及肝臟中MCMV的病毒含量較單純持續(xù)性MCMV感染的小鼠無顯著性差異。 結(jié)論 1.HBV表達(dá)質(zhì)粒的質(zhì)粒骨架、HBV序列組成以及小鼠的基因背景決定了HBV在小鼠體內(nèi)持續(xù)時(shí)間。其中基因背景的差異普遍存在,來源不同的同品系小鼠清除HBV的能力各不相同。HBV特異性T細(xì)胞應(yīng)答是HBV清除的重要機(jī)制,其強(qiáng)弱決定了HBsAg血癥持續(xù)時(shí)間的長(zhǎng)短。 2.既往的HBV感染對(duì)急性MCMV感染的結(jié)局和免疫狀態(tài)沒有顯著影響。但是持續(xù)性MCMV感染對(duì)急性HBV復(fù)制的免疫狀態(tài)和結(jié)局有顯著影響：一方面MCMV記憶細(xì)胞能夠單向提供對(duì)HBV感染的抵抗作用(散發(fā))；另一方面MCMV感染可通過降低的NK細(xì)胞和HBV特異性T細(xì)胞數(shù)量,進(jìn)而減少IFNy分泌,最終導(dǎo)致HBV的清除減慢。這種現(xiàn)象可能與MCMV感染小鼠中升高的Treg細(xì)胞對(duì)HBV特異性免疫應(yīng)答的負(fù)性調(diào)控有關(guān)。繼發(fā)急性HBV復(fù)制對(duì)持續(xù)性MCMV清除無影響 本研究的創(chuàng)新點(diǎn) 1.pAAV/HBV1.2經(jīng)尾靜脈高壓水注射入C57BL/6J小鼠建立的慢性HBV復(fù)制模型已經(jīng)被廣泛認(rèn)識(shí),但在科學(xué)實(shí)踐中,往往不能成功復(fù)制該模型。本研究表明除了小鼠的品系外其來源不同也會(huì)影響到HBV持續(xù)狀態(tài)。 2.首次利用高壓水尾靜脈注射小鼠的HBV復(fù)制模型和MCMV感染模型來模擬人類HBV和CMV共感染對(duì)機(jī)體抗病毒免疫功能以及感染結(jié)局的影響。 本研究的意義 既往的研究表明病毒感染結(jié)局取決于宿主的遺傳背景和病毒致病力,我們的研究表明個(gè)體既往的感染病史可對(duì)新的病毒感染結(jié)局產(chǎn)生影響。本研究建立了MCMV和HBV共感染的小鼠模型,并在此基礎(chǔ)上研究了MCMV感染與急性HBV復(fù)制之間相互影響及可能的免疫學(xué)機(jī)制。這些工作拓寬了我們對(duì)HBV自然感染狀態(tài)下(沒有一個(gè)個(gè)體是未經(jīng)免疫的)機(jī)體對(duì)HBV的免疫應(yīng)答和清除機(jī)制的認(rèn)識(shí)。另外,我們的研究結(jié)果提示在設(shè)計(jì)疫苗時(shí)應(yīng)當(dāng)考慮異種免疫對(duì)新病原體感染的抵抗作用以及對(duì)感染結(jié)局的影響。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R373;R392

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本文編號(hào)：2651400