【摘要】：由于生物基因組進(jìn)化中的保守性,具有某一功能的基因在不同物種之間常具有一定的同源性。這種同源性對(duì)新基因的克隆和功能研究具有指導(dǎo)作用。利用這種基因間的同源性,有目的的克隆基因家族新成員,已經(jīng)成為新基因克隆的有效策略。本論文分為三個(gè)部分,第一和第二部分利用同源策略,克隆到新的人短鏈脫氫酶/還原酶基因SCDR10B和脂肪瘤HMGIC融合伴侶類基因LHFPL1,對(duì)其功能進(jìn)行了初步研究,第三部分對(duì)脯氨酸異構(gòu)酶Cyclophilin J 的生化特性和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。 短鏈脫氫酶/還原酶(Short-chain Dehydrogenases/Reductases,SDR)家族是一個(gè)由很多成員組成的大家族,其中大部分是NAD+或NADP+依賴的氧化還原酶。在本論文第一部分中,我們通過同源篩選的策略,用11β-HSD1為信息探針,拼接并從人腦組織cDNA文庫中克隆到新基因SCDR10B。該基因編碼的蛋白質(zhì)具有保守的短鏈脫氫酶/還原酶結(jié)構(gòu)域,氨基酸序列比較顯示這個(gè)新的推導(dǎo)蛋白與11β-HSD1有較高的同源性和結(jié)構(gòu)相似性,氨基酸序列的一致性為43%,可能是羥類固醇脫氫酶這個(gè)亞家族的新成員。在原核表達(dá)系統(tǒng)中對(duì)SCDR10B基因進(jìn)行了重組表達(dá),重組蛋白免疫兔獲得了其多克隆抗體。酶活性測(cè)定結(jié)果顯示,SCDR10B能以NADP+作為輔基催化氫化可的松脫氫,具有11β-羥類固醇脫氫酶活性,可能與糖皮質(zhì)激素的失活有關(guān)。Northern雜交結(jié)果顯示,SCDR10B轉(zhuǎn)錄本大小約1.7 kb,在腦中高表達(dá)。RT-PCR檢測(cè)顯示其在肺癌細(xì)胞株中呈高表達(dá),免疫組化的結(jié)果也顯示SCDR10B在肺癌組織中高表達(dá),這暗示SCDR10B可能與肺癌有關(guān)。免疫組化的結(jié)果還顯示SCDR10B在小腦膠質(zhì)瘤和腦膜瘤中表達(dá),在正常大腦皮層和海馬神經(jīng)元也有分布。 脂肪瘤為脂肪組織的良性腫瘤,是人類最常見的起源于間葉組織的腫瘤之一。這些腫瘤在細(xì)胞遺傳學(xué)上的特征是染色體畸變,其中有2/3的病例在染色體12q13-15區(qū)域出現(xiàn)染色體易位,12q13-15 區(qū)域的畸變通常會(huì)影響到高速泳動(dòng)蛋白基因HMGIC,目前,在有染色體畸變t(12;13)的脂肪瘤患者中,鑒別出了一個(gè)HMGIC易位伴侶基因LHFP(lipoma HMGIC fusion partner)。在本論文第二部分中,我們以LHFP作為信息探針,克隆到了新基因LHFPL1,該基因定位于染色體Xq23。人17種組織中的表達(dá)譜分析顯示,LHFPL1基因呈廣譜表達(dá),其中肺,胸腺,骨骼肌,結(jié)腸,卵巢表達(dá)豐度高。RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示LHFPL1基因在肝腫瘤細(xì)胞中呈低水平表達(dá)。LHFPL1蛋白含有N端信號(hào)肽以及三個(gè)跨膜結(jié)構(gòu),被預(yù)測(cè)定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng),通過細(xì)胞免疫熒光定位實(shí)驗(yàn)得到證實(shí),可推測(cè)LHFPL1基因在生物體內(nèi)可能通過其所表達(dá)的分泌型的跨膜蛋白行使其功能。此外LHFPL1與LHFP高度同源,今后的研究中可以探討LHFPL1基因 WP=7 在腫瘤發(fā)病中是否象LHFP基因那樣通過基因融和起作用。 人類Cyclophilins是一類在進(jìn)化上高度保守且具有肽酰脯氨酰順反異構(gòu)酶活性的蛋白,這類蛋白廣泛存在于各種組織,其酶活性通常能被CSA抑制。近來的研究還表明,cyclophilin家族的成員除了上述脯氨酸異夠構(gòu)酶活性之外,還具有核酸酶活性,能降解DNA,這種核酸酶活性與凋亡核酸酶比較有許多相似之處,目前認(rèn)為cyclophilin在細(xì)胞凋亡過程中可能起降解染色體DNA的作用。在本論文第三部分中,我們對(duì)本實(shí)驗(yàn)室克隆的cyclophilins家族的新成員CYPJ的生化特性和結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。體外重組表達(dá)純化獲得高純度CYPJ蛋白也具有脯氨酸異構(gòu)酶活性。它是否也具有核酸酶活性呢?我們對(duì)該問題進(jìn)行了較深入的研究,結(jié)果顯示CYPJ在體外能降解質(zhì)粒和基因組DNA,其核酸酶活性可被鈣鎂離子激活,被EDTA抑制,但不能被CSA抑制。凝膠遷移實(shí)驗(yàn)和熒光光譜的結(jié)果顯示CYPJ能與DNA底物結(jié)合,這為其核酸酶活性提供了進(jìn)一步依據(jù)。突變分析顯示,與野生型蛋白相比,R44A突變體的脯氨酸異構(gòu)酶活性明顯減弱,但核酸酶活性下降不明顯;與此相反,K120A突變體核酸酶活性顯著降低,而脯氨酸異夠構(gòu)酶活性不變。我們還利用CD光譜和熒光光譜對(duì)CYPJ在不同環(huán)境條件下的空間結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究,脯氨酸短肽底物能誘導(dǎo)其空間構(gòu)象改變,但二級(jí)結(jié)構(gòu)改變不明顯,抑制劑CSA引起其二級(jí)結(jié)構(gòu)明顯改變。突變后其二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化從而酶活性改變,提示CYPJ的結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,CYPJ蛋白兼具脯氨酸異夠構(gòu)酶和核酸酶兩種酶活性。
【圖文】：

圖 5 人 SCDR10B 基因的 8 種組織表達(dá)譜分析DR10B 基因在不同腫瘤細(xì)胞株中的表達(dá)分析-PCR 方法檢測(cè) SCDR10B 基因，β-微球蛋白作為內(nèi)對(duì)SCDR10B 基因在胃癌細(xì)胞株 SGC7901，白血病細(xì)胞 SHG-44，，肺腺癌細(xì)胞株（不表達(dá) P53 基因）H1299，細(xì)胞肺癌細(xì)胞株 H460，小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株 H446 中均胞株 SPCA-1，大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株 H460，小細(xì)胞肺癌細(xì)

圖 5 人 SCDR10B 基因的 8 種組織表達(dá)譜分析 SCDR10B 基因在不同腫瘤細(xì)胞株中的表達(dá)分析 RT-PCR 方法檢測(cè) SCDR10B 基因，β-微球蛋白作為內(nèi)對(duì)照（示，SCDR10B 基因在胃癌細(xì)胞株 SGC7901，白血病細(xì)胞株 K56株 SHG-44，肺腺癌細(xì)胞株（不表達(dá) P53 基因）H1299，肺腺癌，大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株 H460，小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株 H446 中均有表達(dá)細(xì)胞株 SPCA-1，大細(xì)胞肺癌細(xì)胞株 H460，小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株。β-actin
【學(xué)位授予單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：Q78

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3 劉友良,Steponkus P.L.;脯氨酸對(duì)黑麥原生質(zhì)體膨脹勢(shì)的影響[J];植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào);1990年01期

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本文編號(hào)：2650472