【摘要】：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引起人類多種感染性疾病及食物中毒的重要病原菌之一，它導(dǎo)致的食物中毒和醫(yī)院感染已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)影響公共衛(wèi)生與健康的重要問題。耐熱核酸酶是金黃色葡萄球菌重要的毒力因子之一，同時也是分離鑒定金黃色葡萄球菌的重要判定指標(biāo)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn),一個新的編碼耐熱核酸酶的基因nuc2和已知功能的耐熱核酸酶基因nuc1同時存在于基因組中，并能表達(dá)耐熱核酸酶的活性。本論文從nuc2耐熱核酸酶結(jié)構(gòu)和特性的比較入手，圍繞新的耐熱核酸酶nuc2基因的功能鑒定展開研究，進(jìn)而以基因表達(dá)、功能鑒定、調(diào)控規(guī)律為重點(diǎn)比對分析金黃色葡萄球菌兩種耐熱核酸酶的差異，主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下： 1.采用生物信息學(xué)分析方法對金黃色葡萄球菌基因組中的nuc1、nuc2基因編碼的蛋白質(zhì)序列及結(jié)構(gòu)進(jìn)行比對，構(gòu)建了不同種屬間Nuc蛋白的進(jìn)化樹，揭示了金黃色葡萄球菌兩個核酸酶在進(jìn)化上的差異性。結(jié)果表明，Nuc2是一個在葡萄球菌屬內(nèi)進(jìn)化較為保守的蛋白，而Nuc1則可能起源于其它菌屬的水平轉(zhuǎn)移。此外，在大腸桿菌中成功表達(dá)了兩種核酸酶，對比研究了它們在體外表達(dá)時的酶活性特征，揭示了金黃色葡萄球菌Nuc2的酶學(xué)特征：最適反應(yīng)溫度為50℃，最適pH值為10，是一種非特異核糖核酸酶，適當(dāng)濃度的Ca~(2+)、Mg~(2+)、DTT、β-mecaptoethanol、TritonX-100、Tween-20和Urea都能夠提高Nuc2的酶活性，而Zn~(2+)、Mn~(2+)、EDTA和SDS則是Nuc2酶活性抑制劑。和Nuc1相比，體外表達(dá)的Nuc2酶活性較低，，且對高溫和重金屬離子的耐受力明顯低于Nuc1，這和Nuc2蛋白結(jié)構(gòu)上不穩(wěn)定的推測結(jié)果相符。本實(shí)驗(yàn)從序列、結(jié)構(gòu)到酶活性特征上很好地區(qū)分了金黃色葡萄球菌兩個重要的耐熱核酸酶，對新近發(fā)現(xiàn)的耐熱核酸酶Nuc2的特征作了較為詳盡的研究，為其功能應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。 2.采用Taqman熒光定量PCR方法比較了兩個耐熱核酸酶基因在轉(zhuǎn)錄水平上的差異。通過對金黃色葡萄球菌不同生長階段nuc1和nuc2基因mRNA表達(dá)水平的比較分析，發(fā)現(xiàn)nuc1和nuc2基因在生長過程中的表達(dá)模式并不相同：nuc1基因的表達(dá)在對數(shù)后期達(dá)到最大值，和耐熱核酸酶活性測定結(jié)果一致；nuc2基因則在生長初期達(dá)到最大值，到對數(shù)后期反而降低。另外，通過測定金黃色葡萄球菌雙組分調(diào)節(jié)子sae的缺失突變對nuc1和nuc2基因表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，sae基因缺失顯著下調(diào)nuc1基因的表達(dá)；而nuc2基因在sae缺失突變株中表達(dá)幾乎不受影響。金黃色葡萄球菌臨床分離株中的nuc1基因表達(dá)變化差異明顯，nuc2基因的表達(dá)則相對穩(wěn)定。通過研究nuc1和nuc2基因在表達(dá)上的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)nuc1和nuc2基因受到不同的調(diào)控機(jī)制調(diào)控，且nuc1基因的表達(dá)是決定耐熱核酸酶活性表型的主要因素。 3.利用微生物的同源重組雙交換的遺傳原理，成功構(gòu)建了耐熱核酸酶nuc2基因單缺失突變株和nuc1、nuc2基因雙缺失突變株，并在分子水平進(jìn)行了驗(yàn)證。突變株耐熱核酸酶活性的測定結(jié)果表明，nuc2基因缺失后，酶活性比野生型降低，雙突變株則檢測不到耐熱核酸酶活性。構(gòu)建互補(bǔ)載體轉(zhuǎn)化雙突變株,互補(bǔ)菌株的酶活性測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，nuc1基因互補(bǔ)雙缺失突變株能使其完全恢復(fù)到野生型的酶活水平，nuc2基因的互補(bǔ)只能恢復(fù)菌株nuc1基因突變后Nuc2的酶活表型�；蛲蛔兒突パa(bǔ)實(shí)驗(yàn)確定了nuc2基因在金黃色葡萄球菌中具備耐熱核酸酶活性表達(dá)功能，也進(jìn)一步證實(shí)了nuc1基因在耐熱核酸酶活性表型中占有主導(dǎo)地位的結(jié)論。 4.利用基因表達(dá)譜芯片技術(shù)研究了兩種核酸酶基因突變后對金黃色葡萄球菌RN4220轉(zhuǎn)錄組的影響，采用連鎖轉(zhuǎn)錄及基因代謝途徑定位的新分析方法，對兩種核酸酶基因突變所影響的差異基因進(jìn)行分析，結(jié)果表明，nuc1基因缺失顯著影響了393個基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，而nuc2的缺失顯著影響了89個基因轉(zhuǎn)錄水平的變化。雖然兩組基因都涉及到菌株的氨基酸代謝、糖代謝、復(fù)制修復(fù)、核酸代謝及調(diào)控因子，但在相同位置發(fā)生差異變化的基因只有20個，且調(diào)控水平都不相同。挑選21個差異基因，采用熒光定量PCR驗(yàn)證了芯片結(jié)果的可靠性。值得注意的是，△nuc2缺失突變株和精氨酸脫亞胺酶途徑相關(guān)的基因座均下調(diào)，和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子相關(guān)的基因座上調(diào)，連鎖調(diào)控的代謝途徑還涉及到嘌呤代謝、甘氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸等氨基酸代謝途徑�！鱪uc1基因缺失主要下調(diào)了和磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)、脂代謝及毒力調(diào)控因子的連鎖基因的表達(dá)，上調(diào)了尿素酶基因及蛋白酶基因�！鱪uc1和△nuc2缺失突變株在轉(zhuǎn)錄水平分別調(diào)控了不同的基因表達(dá)，且各有分工。 5.為了更全面了解兩種核酸酶基因的突變對于細(xì)胞代謝功能的影響，利用高通量的表型分析新技術(shù)--表型芯片(PM)研究了金黃色葡萄球菌兩種耐熱核酸酶突變株和親本菌株RN4220的1100多種不同的表型，包括各種碳源、氮源、磷源、硫源的利用，對氨基酸及其他營養(yǎng)物質(zhì)的代謝、滲透特征、pH及抗生素敏感性測試。和金葡親本株相比，Δnuc2突變株的PM結(jié)果有13種表型減弱了1.5倍以上，包括對3種碳、硫源的利用，對7種氮源的利用，涉及氨基酸短肽及氨的代謝。突變株全部下調(diào)的表型說明了nuc2基因?qū)瘘S色葡萄球菌細(xì)胞的生理代謝的正常進(jìn)行起著重要的作用； Δnuc1突變株的差異表型有9個，涉及氮源和磷源的代謝以及6個在酸性pH下的表型變化，和nuc2突變株表型不同的是，Δnuc1突變株中7種表型變化都是增強(qiáng)的，尤其是在酸性pH時突變株的生長和對氨基酸的利用上。25種抗生素敏感性測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Δnuc2突變株和Δnuc1突變株對2-4種頭孢類抗生素的抗性有所增加，這可能與膜蛋白的表達(dá)差異相關(guān)。生長曲線的測定結(jié)果表明，在酸性pH5條件下Δnuc1突變株的生長的明顯高于Δnuc2菌株和野生型，且菌膜形成量明顯增多，這與Δnuc1突變株在酸性條件下代謝表型的增強(qiáng)有重要的聯(lián)系。 總之，本論文揭示了耐熱核酸酶基因nuc2的特征及功能，對兩個耐熱核酸酶在金黃色葡萄球菌中表達(dá)調(diào)控機(jī)制進(jìn)行了探索，為更好地了解金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶的作用機(jī)制具有重要意義。
【圖文】：

上海交通大學(xué)博士學(xué)位論文與功能的作用還知之甚少，僅對于少數(shù)一些重要的核酸酶的一級結(jié)構(gòu)活性位點(diǎn)，同源 性 分 析 和 催 化 機(jī) 制 有 比 較 詳 盡 的 研 究 ， 如 對 金 黃 色 葡 萄 球 菌 核 酸 酶(Staphylococcal nuclease)[67, 68]，粘質(zhì)沙雷氏菌 (Serratia marcescens) 核酸酶[69]，從米曲霉（Aspergillus oryzae）分離的 S1核酸酶[70]，從柑桔青霉（Penicillium citrinum）中分離的 P1 核酸酶[71]和從埃氏交替單胞菌（Alteromonas espejiana）中分離的BAL31 核酸酶[72]。

表達(dá)重組載體所用的菌株；（2）質(zhì)粒 pET-28a 購自 Novagen 公司 (Madison, WI, USA)，質(zhì)粒的限制性圖譜如圖2-1，重組質(zhì)粒載體 pET-28a-nuc1、pET-28a-nuc2 分別包含金葡基因組中 nuc1 基因序列（SA0746）(696 bp) 和 nuc2基因序列（SA1160）(656 bp)，為本實(shí)驗(yàn)室已保存載體[113]。
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R378.11;R3411

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 于梅,徐景野,揚(yáng)元斌;速凍食品中金黃色葡萄球菌的檢出與存活情況[J];現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué);2004年01期

2 唐俊妮;龍飛;史賢明;周銳;;金黃色葡萄球菌基因組DNA提取方法的比較研究[J];中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志;2008年08期

3 李毅;章樂怡;李小春;蔣德媚;梅玲玲;;食品中金黃色葡萄球菌及腸毒素檢測分析報(bào)告[J];中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志;2009年10期

本文編號：2648402