【摘要】：β-細(xì)辛醚是從中藥石菖蒲提取的主要有效成分,它具有廣泛的藥理作用,特別是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面的作用較為顯著。課題組前期發(fā)現(xiàn)β-細(xì)辛醚能顯著改善腦缺血再灌注損傷,同時(shí)能夠改善老年癡呆體外細(xì)胞模型β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷,而且我們觀察到β-細(xì)辛醚能夠通過調(diào)控自噬通路來發(fā)揮保護(hù)作用。自噬作為第二種程序性死亡方式,與神經(jīng)退行性疾病有著密切聯(lián)系,是當(dāng)前生物科學(xué)的熱點(diǎn)研究方向。但是β-細(xì)辛醚對帕金森病模型大鼠的行為學(xué)和神經(jīng)遞質(zhì)是否有改善作用?β-細(xì)辛醚是否能夠通過影響自噬而保護(hù)受損的帕金森病多巴胺神經(jīng)元?其作用機(jī)理是如何?目前,國內(nèi)外還沒有見到相關(guān)的報(bào)道。 本實(shí)驗(yàn)主要由四個(gè)部分組成,第一部分：以6-OHDA模型大鼠為對象,分別研究自噬蛋白Beclin1在紋狀體、皮層、海馬三個(gè)區(qū)域以及酪氨酸羥化酶(TH)在紋狀體和中腦的動(dòng)態(tài)變化；第二部分：以6-OHDA模型大鼠為對象,研究單胺類神經(jīng)遞質(zhì)在腦內(nèi)紋狀體、皮層、海馬三個(gè)區(qū)域的動(dòng)態(tài)變化；第三部分：研究β-細(xì)辛醚對6-OHDA模型大鼠的行為學(xué)、單胺類神經(jīng)遞質(zhì)、TH、α-突觸核蛋白(a-syn)以及自噬的影響,探究其藥效學(xué)基礎(chǔ)。第四部分：基于JNK/Bcl-2通路探討β-細(xì)辛醚改善帕金森病損傷的作用,并探究β-細(xì)辛醚調(diào)節(jié)自噬的具體機(jī)理。 第一部分實(shí)驗(yàn) 目的： 報(bào)道已證實(shí)Beclin1在帕金森病(PD)模型中發(fā)揮重要作用,比如在敲除Beclin1基因的小鼠中發(fā)現(xiàn)多巴胺神經(jīng)元的死亡、多巴胺合成減少、a-syn聚集增多。TH是左旋多巴合成為多巴胺過程中一種重要的限速酶,它的表達(dá)與腦內(nèi)中多巴胺神經(jīng)元和多巴胺的水平成正比。但自噬蛋白Beclin1在PD模型大鼠腦內(nèi)紋狀體、皮質(zhì)、海馬的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況以及TH在中腦和紋狀體的動(dòng)態(tài)表達(dá)情況仍然未知?另外,Beclin1和TH兩者之間的關(guān)系如何?目前國內(nèi)外還未見報(bào)道。本階段的實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖欠謩e考察Beclin1和TH在各自不同部位的動(dòng)態(tài)表達(dá)及其兩者之間的相關(guān)性。 方法： 本實(shí)驗(yàn)采用立體定位注射6-OHDA大鼠來模擬PD模型。將70只SD大鼠分為7組,每組10只,分別為陰性對照組、3h、6h、12h、24h、48h、72h模型組。陰性對照組注射6u L生理鹽水；各模型組左側(cè)的前腦內(nèi)側(cè)束(MFB)注射6-OHDA6μL(24μg)；分別造模至相應(yīng)時(shí)間取腦組織,流式細(xì)胞測定紋狀體、海馬、皮質(zhì)中Beclin1的表達(dá),免疫組化檢測中腦和紋狀體中TH的含量,探討B(tài)eclin1和TH在PD模型中不同部位的動(dòng)態(tài)變化以及兩者之間的關(guān)系。 結(jié)果： 1.三區(qū)域Beclin1動(dòng)態(tài)表達(dá)情況： 海馬區(qū)：Beclin1的表達(dá)在3小時(shí)升高,在24小時(shí)達(dá)到高峰,隨后Beclin1的表達(dá)緩慢下降,直到72小時(shí)達(dá)到穩(wěn)定。與24小時(shí)模型組中Beclin1的表達(dá)比較,其他的組別Beclin1的表達(dá)均顯著下降。 皮質(zhì)區(qū)和紋狀體區(qū)：Beclin1的表達(dá)也在3小時(shí)升高,在12小時(shí)時(shí)達(dá)到高峰,隨后Beclin1的表達(dá)緩慢下降,直到72小時(shí)達(dá)到穩(wěn)定。與12小時(shí)模型組中Beclin1的表達(dá)比較,其他的組別Beclin1的表達(dá)均顯著下降。這些數(shù)據(jù)表明Beclin1在不同部位中發(fā)揮了不同作用。 2.兩區(qū)域TH動(dòng)態(tài)表達(dá)情況： 在中腦和紋狀體中,TH在3到12小時(shí)之間明顯下降,但是在24到72小時(shí)之間其表達(dá)緩慢下降。 3. Beclin1和TH在不同部位之間表達(dá)差異： Beclin1表達(dá)的差異：在12小時(shí)模型組中,紋狀體和皮質(zhì)中Beclin1的表達(dá)明顯高于其在海馬中的表達(dá)。在24小時(shí)模型組中,海馬中Beclin1表達(dá)明顯高于其在皮質(zhì)中的表達(dá)。Beclin1在其他組別中三個(gè)部位間并無明顯差異。 TH表達(dá)的差異：中腦TH表達(dá)在12和24小時(shí)模型組中明顯低于其在紋狀體中的表達(dá)。但是在其他組別中兩個(gè)部位間并無明顯差異。 4. Beclin1和TH表達(dá)之間的關(guān)系： Pearson相關(guān)分析顯示,在0到12小時(shí)之間,Beclin1和TH表達(dá)之間具有明顯的負(fù)相關(guān),但是在12到72小時(shí)之間,兩者之間具有明顯的正相關(guān)。 結(jié)論： 1. Beclin1在紋狀體、皮質(zhì)、海馬的動(dòng)態(tài)表達(dá)： 紋狀體和皮質(zhì)的Beclin1動(dòng)態(tài)表達(dá)情況類似,均在3小時(shí)候升高,在12小時(shí)時(shí)達(dá)到高峰。但是在海馬區(qū),Beclin1的表達(dá)在24小時(shí)達(dá)到高峰。 2.兩區(qū)域TH動(dòng)態(tài)表達(dá)情況： 在中腦和紋狀體中TH動(dòng)態(tài)表達(dá)情況類似。 3. Beclin1在不同部位之間表達(dá)差異： 結(jié)果顯示只有在高峰的時(shí)間,不同部位的Beclin1表達(dá)才具有差異。 4. Beclin1和TH表達(dá)之間的關(guān)系： 在0到12小時(shí)之間,Beclin1和TH表達(dá)之間具有明顯的負(fù)相關(guān),但是在12到72小時(shí)之間,兩者之間具有明顯的正相關(guān)。 第二部分實(shí)驗(yàn) 目的： 報(bào)道已經(jīng)證實(shí)在PD模型中單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量降低,PD的行為學(xué)癥狀肌肉僵直、運(yùn)動(dòng)遲緩、震顫與多巴胺及其代謝物的下降有關(guān)。越來越多的報(bào)道顯示PD還會出現(xiàn)非行為學(xué)的癥狀,比方說嗅覺失常,焦慮癥,失眠癥等。5-羥色胺(5-HT)、5-羥基吲哚乙酸(5-HIAA)以及去甲腎上腺素(NE)的缺失會引起PD非行為學(xué)的癥狀。但是多巴胺(DA)、高香草酸(HVA)、5-HT、5-HIAA以及NE五種神經(jīng)遞質(zhì)在早期PD模型腦內(nèi)紋狀體、皮層、海馬三個(gè)區(qū)域的動(dòng)態(tài)情況如何?幾種神經(jīng)遞質(zhì)者之間的關(guān)系如何?目前國內(nèi)外還未見報(bào)道。本階段的實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖茄芯繂伟奉惿窠?jīng)遞質(zhì)在PD模型腦內(nèi)三個(gè)部位的動(dòng)態(tài)變化。 方法： 本實(shí)驗(yàn)采用立體定位注射6-OHDA大鼠來模擬PD模型。將SD大鼠分為7組,每組10只,分別為陰性對照組、3h、6h、12h、24h、48h、72h模型組。陰性對照組注射6μ L生理鹽水；各模型組左側(cè)MFB注射6-OHDA體積6μL(24μg);分別造模至相應(yīng)時(shí)間取紋狀體、皮層、海馬三個(gè)區(qū)域的腦組織,采用HPLC方法同時(shí)檢測DA、HVA.5-HT、5-HIAA以及NE的含量,并用Pearson相關(guān)分析神經(jīng)遞質(zhì)之間的關(guān)系。 結(jié)果： 1.五種神經(jīng)遞質(zhì)在三個(gè)不同部位動(dòng)態(tài)表達(dá)情況： 紋狀體：當(dāng)6-OHDA注射后,紋狀體中DA水平在3至12小時(shí)之間迅速下降,而且在12至72小時(shí)繼續(xù)下降。但是紋狀體中HVA水平在3至12小時(shí)之間保持穩(wěn)定,而在12到24小時(shí)之間下降明顯。紋狀體中的5-HT和5-HIAA水平在3至72小時(shí)之間保持著直線下降,但是NE水平在3至48小時(shí)之間緩慢下降,而在48至72小時(shí)之間上升到正常水平。 海馬：當(dāng)6-OHDA注射后,海馬中DA和HVA水平在3至24小時(shí)之間緩慢下降,而在24至48小時(shí)保持穩(wěn)定,與紋狀體中DA和HVA的變化有著顯著區(qū)別。海馬中5-HT水平在3到6小時(shí)之間下降明顯,而在6至72小時(shí)之間緩慢下降。但是海馬中的5-HIAA在3至12小時(shí)之間緩慢下降,而在12至48小時(shí)下降較為明顯,直到檢測不到。NE水平在3至48小時(shí)之間緩慢下降,而在48至72小時(shí)上升到正常水平。 皮質(zhì)：當(dāng)6-OHDA注射后,皮質(zhì)中DA和HVA在3至24小時(shí)之間緩慢下降,而在24至48小時(shí)保持穩(wěn)定,變化趨勢與海馬相似。皮質(zhì)中5-GT、5-HIAA以及NE變化與海馬相似。5-HT水平也在3到6小時(shí)之間下降明顯,而在6至72小時(shí)之間緩慢下降。5-HIAA也在3至12小時(shí)之間緩慢下降,而在12至48小時(shí)下降較為明顯,直到檢測不到。NE水平在3至48小時(shí)之間緩慢下降,而在48至72小時(shí)上升到正常水平。 2.神經(jīng)遞質(zhì)在三個(gè)不同部位之間的關(guān)系： Pearson相關(guān)分析顯示,在紋狀體,皮質(zhì)和海馬三個(gè)部位中,DA與5-HT具有較好正相關(guān),但是海馬中NE與三個(gè)部位中DA之間具有較好的負(fù)相關(guān)。 結(jié)論： 1.6-OHDA注射到大鼠MFB后,紋狀體、皮質(zhì)和海馬中五種神經(jīng)遞質(zhì)在3小時(shí)后就就開始下降,一直持續(xù)到72小時(shí)。2.相關(guān)性分析顯示：在紋狀體、皮質(zhì)和海馬三個(gè)部位中,DA與5-HT具有較好正相關(guān),但是海馬中NE與三個(gè)部位中DA之間具有較好的負(fù)相關(guān)。 第三部分實(shí)驗(yàn) 目的： 課題組前期發(fā)現(xiàn)β-細(xì)辛醚能顯著改善腦缺血再灌注損傷,同時(shí)能夠改善老年癡呆體外細(xì)胞模型的β-淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷。但是β-細(xì)辛醚對PD模型大鼠的行為學(xué)和神經(jīng)遞質(zhì)是否有改善作用?是否能通過影響自噬而發(fā)揮對PD模型大鼠的作用?目前國內(nèi)外未見報(bào)道。本階段目的是研究β-細(xì)辛醚對PD模型大鼠行為學(xué)、紋狀體內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)、α-syn以及TH的影響,探明β-細(xì)辛醚對PD模型大鼠的藥效作用基礎(chǔ)。 方法： 本階段實(shí)驗(yàn)選用立體定位注射6-OHDA大鼠來模擬PD模型。將SD大鼠隨機(jī)分為6個(gè)組,每組10只：假手術(shù)組、模型組、β-細(xì)辛醚高劑量組(40mg/kg)、β-細(xì)辛醚中劑量組(20mg/kg)、p-細(xì)辛醚低劑量組(10mg/kg),陽性藥物組(美多巴,75mg/kg)。除假手術(shù)組外,其余組均行立體定位注射6-OHDA大鼠。實(shí)驗(yàn)前后分別用自由活動(dòng)度、滾軸實(shí)驗(yàn)以及前肢運(yùn)動(dòng)功能檢測動(dòng)物的行為學(xué)變化,最后采用大腦灌注,排除血液,斷頭取腦,分別取大腦的皮質(zhì)、海馬、紋狀體等部位,HPLC檢測單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量；ELISA檢測α-syn含量；免疫組化檢測TH含量變化；免疫蛋白印跡檢測Beclin1,LC3B的變化；電鏡觀察自噬體的變化。 結(jié)果： 1.β-細(xì)辛醚對6-OHDA模型大鼠行為學(xué)的影響： 與模型組大鼠的自主活動(dòng)計(jì)數(shù)和滾軸實(shí)驗(yàn)比較,給予β-細(xì)辛醚高、中、低劑量后,其自主活動(dòng)計(jì)數(shù)和平衡能力明顯增高。在β-細(xì)辛醚的高、中、低劑量中,低劑量組(10mg/kg)大鼠在自主活動(dòng)計(jì)數(shù)表現(xiàn)較好。 與正常組大鼠的前肢啟動(dòng)時(shí)間(IT)以及步伐時(shí)間(ST)比較,模型組大鼠IT以及ST均上升。與模型組大鼠的IT以及ST實(shí)驗(yàn)比較,給予β-細(xì)辛醚高、中、低劑量后,其IT以及ST均顯著性降低。而且在β-細(xì)辛醚的高、中、低劑量中,各組劑量大鼠在IT以及ST實(shí)驗(yàn)中并無顯著性差異。 2.β-細(xì)辛醚對6-OHDA模型大鼠單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的影響： 與正常組比較,模型組單胺類神經(jīng)遞質(zhì)均顯著下降。模型組大鼠給予β-細(xì)辛醚高、中、低劑量后,其腦內(nèi)DA和5-HT含量無明顯差異。但是β-細(xì)辛醚高、中、低劑量均能升高模型組中HVA、3,4-二羥苯基-乙酸(Dopacl)、5-HIAA含量。而且β-細(xì)辛醚的高、中、低劑量對HVA、Dopacl和5-HIAA含量無明顯差異。 3.p-細(xì)辛醚對6-OHDA模型大鼠α-syn以及TH含量的影響： 與正常組比較,模型組腦內(nèi)的α-syn顯著上升。模型組大鼠給予β-細(xì)辛醚高、中、低劑量后,能夠顯著降低a-syn的含量。而且在β-細(xì)辛醚的高、中、低劑量中,各組劑量大鼠在降低a-syn的含量中變現(xiàn)并無顯著性差異。 與正常組比較,模型組中的TH含量顯著下降。模型組大鼠給予β-細(xì)辛醚高、中、低劑量后,能夠顯著提高TH含量,但是β-細(xì)辛醚的高、中、低劑量對TH含量并無顯著性差異。 4.β-細(xì)辛醚對6-OHDA模型大鼠中自噬的影響 與正常組比較,模型組的Beclin1和LC-3B蛋白表達(dá)顯著上升。模型組大鼠給予β-細(xì)辛醚高、中、低劑量后,能夠顯著降低Beclin1和LC-3B蛋白表達(dá)。在β-細(xì)辛醚的高、中、低劑量中,低劑量組(10mg/kg)降低Beclin1和LC-3B蛋白的表達(dá)表現(xiàn)較好。而且我們用電鏡觀察正常組、模型組、β-細(xì)辛醚低劑量、自噬激活劑以及抑制劑組,發(fā)現(xiàn)上述相同的結(jié)果。 結(jié)論： 1.β-細(xì)辛醚改善PD模型大鼠的行為學(xué)。 2.β-細(xì)辛醚能升高紋狀體中HVA、Dopacl以及5-HIAA的含量。 3.β-細(xì)辛醚能降低中腦內(nèi)a-syn含量,并能夠升高中腦部位的TH表達(dá)。 4.β-細(xì)辛醚能降低中腦內(nèi)Beclin1和LC-3B蛋白表達(dá),且低劑量作用顯著,提示其可能影響自噬來發(fā)揮作用。 從行為學(xué)、神經(jīng)遞質(zhì)、TH以、a-syn以及自噬五個(gè)方面證實(shí)β-細(xì)辛醚對PD模型的藥效學(xué)。 第四部分實(shí)驗(yàn) 目的： 前一階段實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,β-細(xì)辛醚從行為學(xué)、神經(jīng)遞質(zhì)、TH以、a-syn以及自噬五個(gè)方面對PD模型發(fā)揮保護(hù)作用,但是β-細(xì)辛醚如何調(diào)控自噬來發(fā)揮對PD的保護(hù)作用?本階段重點(diǎn)研究β-細(xì)辛醚減輕6-OHDA損傷可能的自噬機(jī)制。 課題組前期觀察到β-細(xì)辛醚能提高老年大鼠c-Jun基因的表達(dá),而且能影響JNK/Bcl-2通路改善大鼠缺血再灌注引起的損傷。因此,我們推測β-細(xì)辛醚可能通過影響JNK、p-JNK、Bcl-2以及Beclin1的表達(dá)來減輕6-OHDA對多巴胺神經(jīng)元的損傷。 方法： 本階段實(shí)驗(yàn)選用立體定位注射6-OHDA大鼠來模擬PD模型。將SD大鼠隨機(jī)分為3個(gè)組,每組10只,包括模型組、β-細(xì)辛醚組、JNK抑制劑組。除假手術(shù)組外,其余組大鼠均進(jìn)行立體定位注射6-OHDA。最后采用大腦灌注,排除血液,斷頭取腦,分別檢測各標(biāo)本中Beclin1、JNK、p-JNK以及Bcl-2的含量。 結(jié)果： 1.β-細(xì)辛醚和JNK抑制劑對Beclin1、Bcl-2、JNK和p-JNK的影響： 對比模型組而言,給予JNK和β-細(xì)辛醚后,其腦內(nèi)的Beclin1、JNK和p-JNK含量均顯著下降,但是在JNK抑制劑和β-細(xì)辛醚組別中Bcl-2的含量顯著上升。 結(jié)論： 在6-OHDA模型大鼠中,β-細(xì)辛醚調(diào)節(jié)自噬的分子機(jī)制可能與JNK、p-JNK、Bcl-2以及Beclin1有關(guān)。β-細(xì)辛醚可能先通過降低JNK以及p-JNK的表達(dá),進(jìn)而提高了Bcl-2的表達(dá),使Bcl-2與Beclin1的結(jié)合增強(qiáng),最終導(dǎo)致Beclin1表達(dá)下降,從而有可能降低自噬的水平。 總結(jié)論： 首先,我們用6-OHDA模型研究了Beclin1以及TH在不同部位的動(dòng)態(tài)表達(dá),結(jié)果顯示在造模后的不同時(shí)間段,Beclin1的表達(dá)具有差異,提示Beclin1介導(dǎo)的自噬可能參與帕金森病發(fā)病過程。其次,我們還利用6-OHDA模型研究DA.HVA.5-HT.5-HIAA以及NE在不同部位中的動(dòng)態(tài)表達(dá),結(jié)果提示在紋狀體、皮質(zhì)以及海馬三個(gè)部位中,五種神經(jīng)遞質(zhì)均受到影響,而且變化規(guī)律有所差異,相關(guān)性分析顯示DA與5-HT之間具有較好的正相關(guān),但DA與NE之間有較好的負(fù)相關(guān),提示神經(jīng)遞質(zhì)之間能相互影響。然后,我們從行為學(xué)、神經(jīng)遞質(zhì)、TH、a-syn和自噬五個(gè)方面證實(shí)β-細(xì)辛醚能夠減輕PD模型損傷的作用,而且發(fā)現(xiàn)β-細(xì)辛醚能夠抑制自噬的發(fā)生,提示其可能通過調(diào)控自噬來發(fā)揮作用。最后,在6-OHDA模型大鼠中,以JNK抑制劑為對照,研究p-細(xì)辛醚對Beclin1、Bcl-2、JNK和P-JNK的影響。結(jié)果顯示β-細(xì)辛醚可能通過降低JNK以及p-JNK的表達(dá),進(jìn)而提高了Bcl-2的表達(dá),使Bcl-2與Beclin1的結(jié)合增強(qiáng),最終導(dǎo)致Beclin1表達(dá)下降,從而有可能降低自噬的水平。
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R-332;R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2647208